Новости онкологии

30.01.2012

Новое в тестировании статуса онкогена HER2

Имянитов Евгений Наумович
ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, Санкт-Петербург

Введение

Онкоген HER2 (ERBB2/NEU) был идентифицирован в середине 1980-х гг. посредством различных экспериментальных подходов, в частности, как гомолог рецептора эпидермального фактора роста (Human Epidermal growth factor Receptor 2 – HER2), второй гомолог вирусного онкогена erbB (ERBB2), а также онкоген нейроглиобластомы у крыс (NEU) [Schechter et al., 1994; Coussens et al., 1985; Semba et al., 1985]. Данный ген кодирует рецепторную тирозинкиназу, которая отличается исключительно сильной активностью и способностью образовывать гетеродимеры с другими белками семейства HER (EGFR/HER1, HER2, HER4) [Hudis et al, 2007]. В 1987 г. Dennis Slamon и соавт. продемонстрировали высокую встречаемость активации гена HER2 в опухолях молочной железы и причастность этого явления к агрессивному течению заболевания [Slamon et al., 1987]. Более того, в ходе модельных экспериментов были представлены неопровержимые аргументы в пользу прямого участия онкогена HER2 в процессах злокачественной трансформации; соответственно, направленная инактивация данного гена в опухолевых клетках сопровождалась частичной реверсией злокачественного фенотипа [Wada et al., 1990].

Онкоген HER2 (ERBB2/NEU) был идентифицирован в середине 1980-х гг. посредством различных экспериментальных подходов, в частности, как гомолог рецептора эпидермального фактора роста (Human Epidermal growth factor Receptor 2 – HER2), второй гомолог вирусного онкогена erbB (ERBB2), а также онкоген нейроглиобластомы у крыс (NEU) [Schechter et al., 1994; Coussens et al., 1985; Semba et al., 1985]. Данный ген кодирует рецепторную тирозинкиназу, которая отличается исключительно сильной активностью и способностью образовывать гетеродимеры с другими белками семейства HER (EGFR/HER1, HER2, HER4) [Hudis et al, 2007]. В 1987 г. Dennis Slamon и соавт. продемонстрировали высокую встречаемость активации гена HER2 в опухолях молочной железы и причастность этого явления к агрессивному течению заболевания [Slamon et al., 1987]. Более того, в ходе модельных экспериментов были представлены неопровержимые аргументы в пользу прямого участия онкогена HER2 в процессах злокачественной трансформации; соответственно, направленная инактивация данного гена в опухолевых клетках сопровождалась частичной реверсией злокачественного фенотипа [Wada et al., 1990].

На основании убедительных лабораторных данных рецептор HER2 был признан перспективной мишенью для противоопухолевой терапии. Первым препаратом, созданным для подавления функции HER2 и вошедшим в онкологическую практику, стало гуманизированное антитело трастузумаб (Герцептин; trastuzumab; Herceptin;). Герцептин успешно прошел клинические испытания первой, второй и третьей фаз и в 1998 г. был рекомендован для лечения HER2-позитивного метастатического рака молочной железы (РМЖ) [Slamon et al., 2001]. Последующие клинические испытания были сосредоточены на операбельных пациентках с РМЖ, получавших лечение Герцептином после хирургического удаления опухоли; применение данного препарата сопровождалось достоверным улучшением показателей безрецидивной выживаемости, поэтому Герцептин был зарегистрирован в качестве средства адъювантной терапии HER2-ассоциированных карцином молочной железы [Romond et al., 2005; Joensuu et al., 2006]. Современные тенденции в лечении HER2-позитивных раков включают как разработку новых HER2-антагонистов, так и расширение спектра показаний для применения HER2-ингибиторов. В частности, в арсенале клинических онкологов недавно появился низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы HER2 – лапатиниб (Тайверб, Тайкерб); в настоящее время он разрешен для лечения Герцептин-резистентных РМЖ, а также для комбинированного применения с ингибиторами ароматазы [Ryan et al., 2008; Schwartzberg et al., 2010]. В свою очередь, Герцептин успешно прошел клинические испытания на больных с HER2-позитивным метастатическим раком желудка (РЖ), что стало основанием для модификации стандартов лечения данного заболевания [Schneider-Merck and Trepel, 2010].

Лабораторное тестирование статуса онкогена HER2

В рутинной клинической практике используется 2 основных метода диагностики статуса онкогена HER2: иммуногистохимия (ИГХ) и гибридизация in situ (in situ hybridization, ISH) [Wolff et al., 2007; Sauter et al., 2009].

Иммуногистохимический метод выявления активации HER2 получил наибольшее распространение. Принцип его действия основан на взаимодействии антигена и антител. В качестве антигена выступает определенный эпитоп (участок) белка HER2. К этому эпитопу фирмы-производители диагностических наборов подбирают специфические антитела. Применение иммуногистохимического метода подразумевает инкубацию диагностических антител с иммобилизованным на предметном стекле гистологическим срезом опухоли. При этом антитела взаимодействуют со специфическим белком-антигеном и остаются «прикрепленными» к срезу даже после промывки препарата. Как сделать провзаимодействовавшие антитела видимыми для детекции? Для этого используется технология т.н. «сэндвича», подразумевающая применение вторых, «меченых» антител. Например, если для взаимодействия с антигеном-мишенью используются моноклональные мышиные антитела, то для детекции образовавшихся комплексов антиген-антитело добавляются «антимышиные» антитела, имеющие встроенную метку для визуализации.

Иммуногистохимия имеет колоссальные преимущества по сравнению с другими методами. Эта разновидность анализа чрезвычайно проста, не требует дорогостоящего оборудования и может использоваться в любой морфологической лаборатории. Иммуногистохимия позволяет визуализировать компоненты среза, которые демонстрируют окрашивание, в частности, дифференцировать опухолевую и внеопухолевую экспрессию того или иного белка. Помимо этого, ИГХ помогает локализовать нахождение белка внутри клетки, в частности, дискриминировать между мембранным, цитоплазматическим и ядерным окрашиванием.

Помимо преимуществ, ИГХ имеет целый ряд ограничений. Традиционный протокол иммуногистохимического прокрашивания по своему принципу напоминает проявление черно-белых фотографий в домашних условиях. В случае обработки фотографий критическим фактором является состояние проявителя, а также время и условия инкубации (фотографы-любители знают, что «свежий» проявитель «работает» лучше «старого», и обычно контролируют время инкубации «на глаз», прекращая процесс проявления по мере достижения желаемой интенсивности снимков). В случае иммуногистохимии в качестве «проявителя» выступает раствор специфических антител. Разумеется, применение столь критического реагента подразумевает его одинаковую рабочую активность от партии к партии. В реальности антитела могут частично разрушаться при хранении, особенно при несоблюдении требуемых условий или сроков. Помимо этого, скорость взаимодействия антител и антигена чрезвычайно зависит от температуры инкубации: столь важный фактор должен контролироваться с точностью до градуса, однако подобное требование на практике не всегда выполняется. Многие лаборатории практикуют нанесение раствора антител на поверхность гистологического среза; подобное прокрашивание «в капле» позволяет экономить антитела, но не обеспечивает идеальных условий инкубации. Альтернативой является применение специальных ванночек для предметных стекол, которые предназначены для относительно больших объемов раствора антител (десятки миллилитров); в этом случае условия инкубации отличаются хорошей воспроизводимостью, однако расход антител существенно возрастает. Помимо изложенных выше объективных особенностей метода следует признать, что в большинстве отечественных лабораторий в целях экономии практикуется разведение антител ниже рекомендованных производителем концентраций.

Гибридизация in situ ориентирована на оценку копийности гена-мишени. В качестве специфического зонда используется одноцепочечный нуклеотидный фрагмент гена, помеченный специальной меткой. Этот фрагмент гибридизуется с гистологическим препаратом, содержащим денатурированную ДНК. ДНК-зонд распознает ген-мишень по принципу комплементарности и образует двуцепочечные молекулы ДНК. Каждая копия гена визуализируется в виде отдельной «точки». В норме клетки (ядра) содержит 2 точки, при делеции генетического материала количество точек на клетку уменьшается до 1 или 0, а при амплификации – возрастает в зависимости от степени увеличения копийности гена. Результаты ISH обычно оценивают при помощи подсчета количества «точек» в нескольких десятках клеток опухоли. В отличие от иммуногистохимии, в ISH всегда присутствует внутренний стандарт. При оценке геномного статуса HER2 в качестве контроля может использоваться фрагмент генетического материла, расположенный в центре хромосомы 17; увеличение копийности гена HER2, локализованного на длинном плече той же хромосомы, выражается соотношением количества HER2-специфических и контрольных сигналов. В случае отсутствия гена-рефери копийность гена HER2 оценивается по среднему количеству сигналов HER2 в ядрах опухолевых клеток; при этом нормальные клетки гистологического препарата, содержащие 2 копии гена, выступают в качестве контроля. В отличие от ИГХ, ISH отличается объективностью оценки результатов и хорошей воспроизводимостью.

Наибольшее распространение получила т.н. флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). К недостаткам этого метода следует отнести проблематичность визуальной гистологической оценки препарата, а также необходимость в специальном оборудовании. Значительную популярность приобрели различные модификации FISH, в частности «chromogenic in situ hybridization» (CISH, хромогенная гибридизация in situ). В отличие от исходного метода, в CISH используются цветные метки, поддающиеся визуализации в обычном световом микроскопе. Таким образом, CISH не требует специального оборудования для детекции флуоресцентного сигнала и позволяет осуществлять гистологическую оценку изучаемого препарата [Tanner et al., 2000].

Показания к HER2-тестированию

Статус онкогена HER2 определяется у всех больных, для которых рассматривается вопрос о применении антагонистов этого рецептора. Наиболее очевидной категорией пациенток являются женщины с метастатическим раком молочной железы. Другую группу больных составляют прооперированные случаи инвазивного РМЖ, для которых может представляться целесообразным адъювантное лечение Герцептином. Следует учитывать, что показания к специфическому адъювантному лечению HER2-позитивных РМЖ достаточно широки. В частности, они включают опухоли с наличием как минимумом 1 вовлеченного лимфатического узла или отсутствием экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона; если же РМЖ демонстрирует положительную окраску по ER и/или PR и имеет статус N0, то наличие даже одного дополнительного фактора риска рецидива (размер карциномы более 2 см; умеренная или высокая степень злокачественности опухоли; возраст пациентки моложе 35 лет) считается достаточным оправданием для назначения Герцептина. Таким образом, в качестве кандидатов для адъювантного лечения данным препаратом не рассматриваются только те исключительно редкие случаи РМЖ, которые характеризуются маленьким размером первичного новообразования, отсутствием лимфогенного метастазирования на момент диагноза, низкой степенью злокачественности опухоли, наличием гормональных рецепторов и возрастом старше 35 лет. Следует прокомментировать, что карциномы молочной железы in situ (внутрипротоковые раки без инвазивного компонента), несмотря на частую гиперэкспрессию HER2, не подвергаются адъювантному лечению антагонистами данной тирозинкиназы.

Помимо РМЖ, HER2-тестированию подлежат метастатические аденокарциномы желудка или кардиоэзофагальной «переходной» зоны. Следует подчеркнуть, Герцептин зарегистрирован только в качестве компонента терапии первой линии, т.е. те пациенты, которые уже получали терапию по поводу метастатического рака, не могут рассматриваться в качестве кандидатов на лечение данным препаратом.

Новое в стандартах HER2-тестирования

Опыт клинического применения Герцептина, а также появление дополнительных показаний к его назначению несколько видоизменили стандарты HER2-тестирования. Примечательно, что в настоящее время существуют некоторые различия в подходах к определению статуса HER2 при раке молочной железы и желудка.

В диагностике рака молочной железы в настоящее время сосуществуют 2 альтернативных подхода к выявлению активации HER2. Первый предусматривает двухэтапную процедуру. Исследование начинается с иммуногистохимического анализа экспрессии HER2-белка. Случаи с сильным окрашиванием (3+) сразу расцениваются как HER2-позитивные и отбираются на терапию Герцептином без каких-либо дополнительных процедур. РМЖ с отсутствием реактивности (0) или слабым окрашиванием (1+) исключаются из дальнейшего рассмотрения. Образцы со степенью окраски 2+ повергаются дополнительной процедуре – ISH-анализу – и направляются на лечение Герцептином только в случае обнаружения амплификации гена HER2 [Wolff et al., 2007; Sauter et al., 2009]. Альтернативный подход к HER2-тестированию предусматривает полный отказ от иммуногистохимии и использование ISH в качестве единственного лабораторного метода HER2-анализа [Sauter et al., 2009]. Сторонники теста на амплификацию гена HER2 акцентируют внимание на общеизвестных недостатках ИГХ (недостаточная межлабораторная воспроизводимость и субъективизм оценки результатов), а также на почти полное соответствие геномного и экспрессионного статуса данного онкогена. Существенно, что один из главных аргументов против расширенного использования ISH – несколько большая стоимость по сравнению с ИГХ – представляется абсолютно несостоятельным, если принять во внимание потенциальный источник экономии – отказ от заведомо безрезультатного многомесячного лечения HER2-ингибиторами.

Опыт HER2-тестирования РМЖ показывает, что ложно-позитивные результаты встречаются значительно чаще ложно-негативных. В целях устранения этого недостатка в 2007 г. были значительно сужены критерии, позволяющие расценивать опухоль как 3+ по результатам иммуногистохимического теста и проводить лечение Герцептином без подтверждения активации этого гена посредством ISH-анализа. Если ранее для присуждения статуса 3+ считалось достаточным выявить сильное мембранное окрашивание как минимум 10% опухолевых клеток, то в настоящее время этот порог повышен до 30% [Wolff et al., 2007].

Рекомендации к HER2-тестированию опухолей желудка заметно отличаются от таковых для РМЖ. Во-первых, анализ состояния гена HER2 всегда начинается с иммуногистохимического исследования. Во-вторых, для присвоения статуса 3+ достаточно наблюдать выраженное окрашивание 10% исследованных клеток. В третьих, при анализе карцином желудка не применяется требование к полному мембранному окрашиванию. В четвертых, рекомендуется анализировать несколько участков опухоли (как минимум 6-8), при этом обнаружение активации гена HER2 даже в одном из исследованных образцов расценивается как достаточное условие для назначения Герцептина [Rüschoff et al., 2010].

Все перечисленные выше подходы к идентификации HER2-активированных опухолей имеют значительные ограничения, поэтому в настоящее время осуществляется интенсивный поиск новых методов HER2-тестирования. В частности, исключительно хорошие результаты продемонстрировал протокол оценки статуса HER2 по уровню его экспрессии на уровне РНК, основанный на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР; polymerase chain reaction, PCR). При использовании данной методики из опухолевого материала сначала выделяется тотальная РНК, а затем на матрице РНК при помощи фермента обратной транскриптазы синтезируется комплементарная ДНК (кДНК); именно кДНК является непосредственным субстратом для молекулярного анализа. В ходе ПЦР-теста осуществляется мониторинг кинетики накопления HER2-специфического продукта в режиме реального времени (real-time PCR). Примечательно, что в случае активации гена HER2 наблюдается 100-кратное и более увеличение уровня его транскрипта; столь высокие отличия от «нормального» статуса HER2 значительно облегчают отбор пациентов на лечение HER2-ингибиторами [Baehner et al., 2010; De et al., 2010].

Литература

  1. Baehner FL, Achacoso N, Maddala T, Shak S, Quesenberry CP Jr, Goldstein LC, Gown AM, Habel LA. Human epidermal growth factor receptor 2 assessment in a case-control study: comparison of fluorescence in situ hybridization and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction performed by central laboratories. J Clin Oncol. 2010 Oct 1; 28(28):4300-6.
  2. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, Seeburg PH, Libermann TA, Schlessinger J, Francke U, Levinson A, Ullrich A: Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science. 1985 Dec 6; 230(4730):1132-9.
  3. De P, Smith BR, Leyland-Jones B. Human epidermal growth factor receptor 2 testing: where are we? J Clin Oncol. 2010 Oct 1; 28(28):4289-92.
  4. Hudis CA. Trastuzumab--mechanism of action and use in clinical practice. N Engl J Med. 2007 Jul 5; 357(1):39-51.
  5. Joensuu H, Kellokumpu-Lehtinen PL, Bono P, Alanko T, Kataja V, Asola R, Utriainen T, Kokko R, Hemminki A, Tarkkanen M, Turpeenniemi-Hujanen T, Jyrkkiö S, Flander M, Helle L, Ingalsuo S, Johansson K, Jääskeläinen AS, Pajunen M, Rauhala M, Kaleva-Kerola J, Salminen T, Leinonen M, Elomaa I, Isola J; FinHer Study Investigators. Adjuvant docetaxel or vinorelbine with or without trastuzumab for breast cancer. N Engl J Med. 2006 Feb 23; 354(8):809-20.
  6. Romond EH, Perez EA, Bryant J, Suman VJ, Geyer CE Jr, Davidson NE, Tan-Chiu E, Martino S, Paik S, Kaufman PA, Swain SM, Pisansky TM, Fehrenbacher L, Kutteh LA, Vogel VG, Visscher DW, Yothers G, Jenkins RB, Brown AM, Dakhil SR, Mamounas EP, Lingle WL, Klein PM, Ingle JN, Wolmark N. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med. 2005 Oct 20; 353(16):1673-84.
  7. Rüschoff J, Dietel M, Baretton G, Arbogast S, Walch A, Monges G, Chenard MP, Penault-Llorca F, Nagelmeier I, Schlake W, Höfler H, Kreipe HH. HER2 diagnostics in gastric cancer-guideline validation and development of standardized immunohistochemical testing. Virchows Arch. 2010 Sep; 457(3):299-307.
  8. Ryan Q, Ibrahim A, Cohen MH, Johnson J, Ko CW, Sridhara R, Justice R, Pazdur R. FDA drug approval summary: lapatinib in combination with capecitabine for previously treated metastatic breast cancer that overexpresses HER-2. Oncologist. 2008 Oct; 13(10):1114-9.
  9. Sauter G, Lee J, Bartlett JM, Slamon DJ, Press MF. Guidelines for human epidermal growth factor receptor 2 testing: biologic and methodologic considerations. J Clin Oncol. 2009 Mar 10; 27(8):1323-33.
  10. Schechter AL, Stern DF, Vaidyanathan L, Decker SJ, Drebin JA, Greene MI, Weinberg RA. The neu oncogene: an erb-B-related gene encoding a 185,000-Mr tumour antigen. Nature. 1984 Dec 6-12; 312(5994):513-6.
  11. Schneider-Merck T, Trepel M. Lapatinib. Recent Results Cancer Res. 2010; 184:45-59.
  12. Schwartzberg LS, Franco SX, Florance A, O'Rourke L, Maltzman J, Johnston S. Lapatinib plus letrozole as first-line therapy for HER-2+ hormone receptor-positive metastatic breast cancer. Oncologist. 2010; 15(2):122-9.
  13. Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v-erbB-related protooncogene, c-erbB-2, is distinct from the c-erbB-1/epidermal growth factor-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 1985 Oct; 82(19):6497-501.
  14. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987 Jan 9; 235(4785):177-82.
  15. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A, Fleming T, Eiermann W, Wolter J, Pegram M, Baselga J, Norton L. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med. 2001 Mar 15; 344(11):783-92.
  16. Tanner M, Gancberg D, Di Leo A, Larsimont D, Rouas G, Piccart MJ, Isola J. Chromogenic in situ hybridization: a practical alternative for fluorescence in situ hybridization to detect HER-2/neu oncogene amplification in archival breast cancer samples. Am J Pathol. 2000 Nov; 157(5):1467-72.
  17. Wada T, Myers JN, Kokai Y, Brown VI, Hamuro J, LeVea CM, Greene MI. Anti-receptor antibodies reverse the phenotype of cells transformed by two interacting proto-oncogene encoded receptor proteins. Oncogene. 1990 Apr; 5(4):489-95.
  18. Wolff AC, Hammond ME, Schwartz JN, Hagerty KL, Allred DC, Cote RJ, Dowsett M, Fitzgibbons PL, Hanna WM, Langer A, McShane LM, Paik S, Pegram MD, Perez EA, Press MF, Rhodes A, Sturgeon C, Taube SE, Tubbs R, Vance GH, van de Vijver M, Wheeler TM, Hayes DF; American Society of Clinical Oncology; College of American Pathologists. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol. 2007 Jan 1; 25(1):118-45.