Библиотека

Опухолевые супрессоры и мутаторные гены

Копнин Б.П.

ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва

3.2. pRb - первый идентифицированный опухолевый супрессор

3.2.1. Открытие гена Rb

Идентификация опухолевых супрессоров началась с обнаружения гена Rb, врожденные мутации которого вызывают развитие ретинобластом. В начале 1970-х г.г. Кнудсон, проводя эпидемиологические исследования, отметил, что около 40% ретинобластом возникает в младенческом возрасте (средний возраст 14 месяцев). Причем эти опухоли как правило билатеральные (возникают из сетчатки обоих глаз) и часто множественные (в среднем по 3 независимых опухоли на пациента). Если такие пациенты в результате хирургического вмешательства излечивались от ретинобластом, у многих из них в юношеском возрасте развивались остеосаркомы, а в зрелом возрасте - меланомы кожи. При этом во многих случаях отмечался наследственный характер заболевания. Кнудсон сформулировал гипотезу, согласно которой, если дети наследуют мутантный аллель гена, позже названного Rb, то вторая мутация, происходящая уже в ретинобласте, ведет к возникновению опухоли. Это довольно частое событие (происходит примерно у 95% пациентов с частотой около трех на пациента) и, поэтому, предрасположение к развитию болезни имеет доминантный характер наследования. Кнудсон предположил также, что дети, у которых ретинобластомы возникают в более позднем возрасте (частота таких опухолей невелика - 1 на 30000 индивидуумов), не наследуют мутантный аллель гена Rb. Вместо этого у них происходят две независимые мутации в одном из ретинобластов, что и приводит к развитию опухоли. Следовательно, согласно гипотезе Кнудсона, у первой группы пациентов имеется одна врожденная и одна приобретенная мутации, тогда как у второй группы больных обе мутации приобретенные.

Так как при некоторых наследственных ретинобластомах обнаруживались небольшие делеции участка длинного плеча хромосомы 13 (13q14), было предположено, что ген "предрасположенности к ретинобластоме" (Rb) локализуется именно в этом участке генома. И действительно, с помощью позиционного клонирования был изолирован ген, оба аллеля которого инактивированы в клетках как наследственных, так и спорадических ретинобластом. При этом при наследственных формах заболевания все клетки организма имели врожденные мутации этого гена. Таким образом, стало ясно, что постулируемые Кнудсоном две мутации, необходимые для развития ретинобластом, происходят в разных аллелях одного и того же гена Rb. Инактивация гена Rb была обнаружена не только в ретинобластомах, но и в клетках некоторых других, ненаследственных новообразований: практически во всех случаях мелкоклеточного рака легкого, части случаев (20-40%) острого лейкоза, остеосаркомы, рака мочевого пузыря, простаты и др. Восстановление экспрессии этого гена в культивируемых in vitro клетках ретинобластом и остеосарком приводило к торможению их роста. Таким образом, впервые были получены веские доказательства существования генов, полная инактивация которых приводит к развитию новообразований и продукты которых способны подавить размножение неопластических клеток. Закономерности, выявленные при исследовании гена Rb, в частности ассоциация с наследственными формами опухолей и необходимость поражения обоих аллелей (рецессивный характер проявления мутаций), стали использоваться в качестве критериев при поиске и идентификации других опухолевых супрессоров.

В настоящее время достигнут значительный прогресс в понимании нормальной функции продукта гена Rb (pRb) в клетке, охарактеризованы типы и местоположение мутаций в гене Rb при ретинобластомах и других новообразованиях, предложены высокоэффективные методы скрининга мутаций Rb у индивидуумов в группах риска.

3.2.2. Функция pRb в клетке и ее нарушения при канцерогенезе

pRb представляет собой фосфобелок c мол. массой 105кД, локализующийся в ядре и экспрессирующийся в большинстве типов клеток. Он дефосфорилирован в неделящихся клетках, а также в пролиферирующих клетках, находящихся в начале G1 фазы клеточного цикла. В таком состоянии pRb образует комплексы с рядом белков, в том числе с белками, вызывающими ремоделирование хроматина (гистоновые деацетилазы HDAC, комплексы SWI-SNF) и транскрипционными факторами семейства E2F, регулирующими активность генов, продукты которых необходимы для начала и прохождения S-фазы (циклин Е, циклин А, дигидрофолатредуктаза, тимидинкиназа, PCNA, ДНК-полимераза a и др). Транскрипция этих генов подавлена, если E2F связан с комплексами HDAC/pRb/SWI-SNF. При митогенных сигналах pRb в середине G1 фазы фосфорилируется по определенным аминокислотным остаткам циклинзависимой киназой циклин D/Сdk4(6), что вызывает отвязывание от него HDAC. Комплекс pRb/SWI-SN (без HDAC) не блокирует способность E2F транс-активировать ген циклина E, но репрессирует транскрипцию других E2F-регулируемых генов, в частности циклина А. В результате в конце G1 фазы происходит избирательная активация циклинзависимой киназы циклин Е/Cdk2, которая дополнительно фосфорилирует pRb по другим аминокислотным остаткам. Это вызывает высвобождение транскрипционного фактора E2F из комплексов с pRb/SWI-SNF и его активацию, приводящую к повышению экспрессии циклина А и других генов, продукты которых необходимы для синтеза ДНК (Рис. 1).

Рис. 1. pRb регулирует активность транскрипционных факторов семейства E2F и циклинзависимых киназ, ответственных за вход и продвижение по S фазе клеточного цикла (объяснения в тексте).

После завершения S фазы pRb переходит в дефосфорилированное состояние, в котором он блокирует активность E2F и вход в следующую S фазу (для ее инициации необходим новый митогенный стимул, активирующий комплексы циклин D/Cdk4). Таким образом, модулируя активность E2F и регулируемых им генов, pRb играет ключевую роль в контроле последовательности событий, обеспечивающих переход клетки из G0/G1 в S фазу и ее успешное завершение.

В дополнение к E2F pRb связывает и модулирует активность ряда других транскрипционных факторов, большинство из которых тканеспецифичны и участвуют в регуляции определенных дифференцировочных программ. Так, он увеличивает транскрипционную активность некоторых представителей семейства bHLH (MyoD и др.), которые стимулируют мышечную дифференцировку и семейства C/EBP, играющих ключевую роль в моноцитарно-макрофагальной (NF-IL6) и адипоцитарной (C/EBP-b) дифференцировках. Кроме того, pRb связывает и репрессирует гомеобокс-содержащие транскрипционные факторы (Pax-3, Mhox, Chx10), определяющие судьбу клетки в раннем эмбрионенезе. Все это дало основание полагать, что основная физиологическая функция pRb заключается в детерминировании некоторых терминальных дифференцировок, для чего необходима остановка клеточного цикла (осуществляется за счет подавления функции E2F) и индукция экспрессии ряда специализированных белков (реализуется путем модификации активности тканеспецифичных транскрипционных факторов).

Значительная часть мутаций гена Rb, обнаруживаемых в различных опухолях, вызывают либо делецию гена, либо сдвиг кодирующей рамки, либо ее преждевременную терминацию, либо нарушения сплайсинга мРНК. Все это приводит или к полной потере экспрессии белкового продукта, или к экспрессии неполноценных и нестабильных белков pRb. В части случаев наблюдаются миссенс-мутации, вызывающие замену одного из аминокислотных остатков. Такие мутации поражают домен, ответственный за связывание pRb c рядом клеточных белков и вирусными онкобелками - T-SV40, E1A аденовирусов и E7 HPV. По-видимому нарушение функции именно этого домена, вызываемое либо мутациями, либо его связыванием с вирусными онкобелками, является критичным для подавления супрессорной активности pRb.

При мутациях обоих аллелей гена Rb, вызывающих отсутствие в клетке белка pRb или экспрессию его функционально неактивной формы, транскрипционный фактор E2F находится в перманентно активированном состоянии. Это, во-первых, уменьшает зависимость размножения клеток от ростовых факторов, а во-вторых, отменяет негативную регуляцию клеточной пролиферации при рост-ингибирующих сигналах. Кроме того, потеря функции pRb нарушает процессы клеточной дифференцировки. Все это резко увеличивают вероятность появления постоянно пролиферирующих клонов клеток, в которых будут накапливаться и другие онкогенные мутации, ведущие к злокачественной трансформации. При этом, пока остается неясным, почему при врожденной инактивации одного из аллелей гена Rb во всех клетках организма у пациента в юном возрасте развивается именно ретинобластома, а не какие-то другие новообразования. Интересно, что у трансгенных мышей с инактивацией одного из аллелей гена Rb (инактивация обоих аллелей несовместима с жизнью эмбрионов из-за нарушений эритропоэза и нейрогенеза) возникают не ретинобластомы, а медуллярные раки щитовидной железы или аденомы средней доли гипофиза, возникающие из меланофоров (в отличие от мышей у человека эта ткань в гипофизе атрофирована). Более того, ретинобластомы не развиваются и у химерных мышей, во всех клетках сетчатки которых инактивированы оба аллеля гена Rb. Отсутствие ретинобластом у таких химерных мышей может быть объяснено относительно небольшим, по сравнению с человеком, количеством клеток в сетчатке, что уменьшает вероятность возникновения в течение короткой жизни животного в одном из ретинобластов дополнительных генетических изменений, необходимых для развития новообразования. Меньшая вероятность таких событий может быть также связана с отсутствием у лабораторных мышей дополнительных канцерогенных факторов, таких как облучение клеток сетчатки солнечным светом, способствующему, очевидно, развитию ретинобластом в аналогичной ситуации у человека. В пользу предположения о необходимости для развития ретинобластом дополнитльных событий может свидетельствовать тот факт, что ретинобластомы возникают у трансгенных мышей, экспрессирующих вирусный онкобелок T-SV40, который связывает и инактивирует не только pRb, но и его гомологи (см. ниже), а также другой опухолевый супрессор - р53 (см. раздел 3.3).

3.2.3. Гомологи pRb: p107 и Rb2/p130

Несколько позже, в начале 90-х гг. было идентифициоровано два гена, продукты которых, белки р107 и Rb2/p130, имеют структурное сходство и частично перекрывающиеся функции с pRb. Так, подобно pRb, они способны подавлять активность E2F-респонсивных генов и блокировать вход в фазу S. Вместе с тем, они имеют ряд отличий от pRb. В частности, они связывают только E2F4 и E2F5, тогда как рRb взаимодействует с E2F1, E2F2, E2F3 и E2F4. Возможно поэтому р107 и Rb2/p130, в отличии от pRb, не способны поддерживать длительное пребывание в G0 и дифференцировку некоторых типов клеток, например миоцитов.

Нарушения функции гомологов pRb, по-видимому, не причастны к инициальным этапам развития каких-либо опухолей человека, так как пока не выявлены наследственные формы новообразований с врожденными герминальными мутациями генов р107 или Rb2/p130. Кроме того, у мышей с гетерозиготным нокаутом этих генов частота возникновения опухолей не повышается. В то же время соматические инактивирующие мутации гена Rb2/p130 характерны для части случаев лимфомы Беркита, рака носоглотки и мелкоклеточного рака легкого, причем, как правило, они выявляются на поздних стадиях заболевания. Вероятно, нарушения функции этого гомолога pRb обеспечивают прогрессию некоторых новообразований.