Материалы конгрессов и конференций

X РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИНТЕРНАЛИЗУЕМЫХ ХИМЕРНЫХ ПЕПТИДОВ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ НОВЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ

В.П. Харченко, В.К. Боженко
ФГУ РНЦ Рентгенорадиологии Росздрава, Москва

В настоящее время общепринято, что основополагающими признаками неопластической клетки являются нарушения регуляции клеточного цикла и апоптоза. Известно, что регуляция процессов пролиферации клетки контролируется путем последовательной активации циклинов и соответствующих циклин-зависимых киназ (Cdk). Активность циклиновых киназ определяется уровнем экспрессии соответствующих циклинов и активностью специфических ингибиторов циклиновых киназ. Имеется несколько семейств ингибиторов циклиновых киназ. Наиболее изученными и практически важными из них являются р16INK4a, p21CIP/KIP, p27 KIP1. Мутации или гиперметилирование промоторов генов ингибиторов циклиновых киназах наблюдаются в 40-60% случаев злокачественных лимфом, при раке поджелудочной железы и ряде других злокачественных новообразований. Синтезирован ряд низкомолекулярных ингибиторов циклиновых киназ, и проходит их экспериментальное изучение как потенциальных противоопухолевых средств. Другим возможным направлением создания ингибиторов циклиновых киназ может быть использование функциональных последовательностей из соответствующих внутриклеточных ингибиторов. Белок р16 INK4a является одним из наиболее интересных кандидатов этой группы. Известно, что р16INK4a ингибирует циклин-зависимые киназы D и, тем самым, прохождение G1 фазы клеточного цикла. Показано, что его функция нарушена при широком спектре онкологических заболеваний. Другим возможным кандидатом на использование в качестве ингибитора пролиферации является белок р21, ингибирующий циклиновые киназы всех типов.

До настоящего времени проблему восстановления нарушенной функции пытались решать на основе методов доставки гена (генная терапия) (Георгиев Г.П., 2000; Wender Р.А. et al., 2000; Барышников А.Ю., 2004). Однако, эта технология до настоящего времени не получила широкого выхода в клиническую практику из-за ряда принципиальных проблем. В последнее время интерес к этому направлению опять возрос, и в печати появились экспериментальные работы, описывающие применение гена р16INK4a для терапии опухолей различного генеза (Lee A.W.C., Li J-H et. al., 2003; Liu S.X., Tang S.Q., Liang C.Y., 2003; Zhang Y., Liu J. et al., 2005).

Неудачи практического использования методов генной терапии послужили дополнительным мотивом к поиску новых технологических подходов для применения естественных белковых ингибиторов пролиферации. Возможным решением проблемы внутриклеточной доставки может являться открытие коротких последовательностей аминокислот (n=15-30), способных выполнять векторные функции. (Fawell S., Seery J. et al., 1994; Vives E., Brodin P., Lebleu B., 1997; Kaplan I.M. et al., 2005; Gupta B. et al., 2005; Fernandez-Carneado J. et al., 2005). Пептидные последовательности, обладающие внутриклеточной транспортной функцией, принято называть "интернализуемыми". В мировой литературе встречается также название «сell penetrating peptides» (CPP).

Альтернативный способ решения проблемы доставки функциональных последовательностей, основанный на технологии пептидных векторов, обладающих способностью проникать в клетки, не повреждая плазматическую мембрану, является весьма перспективным ввиду слабой иммуногенности таких соединений и способности переносить достаточно крупные молекулы. Соединение возможности целевой доставки пептидов в клетку и обнаружение коротких функциональных доменов в белках регуляторах различных клеточных функций создали предпосылки для конструирования молекул, имеющих конкретную патогенетическую направленность (Schutze-Redelmeier M.P. и др., 2004; Trehin R., Merkle H.P., 2004; Cong-Mei Wu и др., 2004). Относительная простота синтеза таких молекул позволяет говорить о принципиальной возможности создания на их основе индивидуальных химиопрепаратов, влияющих на патологические изменения свойственных данной конкретной опухоли (Perea S.E. и др., 2004).

Основные свойства, объединяющие различные по структуре пептиды в этот класс заключаются в следующем:

  • быстро проникают в клетки, время проникновения составляет несколько минут;
  • нет избирательности по отношению к типу клеток; пептид накапливается в 100% клеток;
  • проникновение не носит рецепторный характер;
  • проникновение не зависит от температуры в пределах от 4°C до 37°C;
  • низкая иммуногенность;
  • не используется фаго- или пиноцитозный путь.

В табл. 1 приводятся примеры соединений, для которых показана возможность внутриклеточной доставки с помощью пептидных векторов.

Таблица 1.
Примеры частиц, которые могут быть добавлены в клетки с помощью интернализуемых пептидов.

Размер Вид частиц
До 1 нм Органические молекулы
1-10 нм Пептиды
1-10 нм Олигонуклеотиды
10-50 нм Полноразмерные белки
40 нм Магнитные наночастицы

Интернализуемые пептидные последовательности можно классифицировать по происхождению. В табл. 2 приведены примеры наиболее изученных интернализуемых последовательностей, полученных из различных источников.

Таблица 2.
Примеры аминокислотных последовательностей некоторых интернализуемых пептидов.

Название Источник Аминокислотная последовательность
Пептиды, полученные из белков
Пенетратин (Antp) Белок Antennapedia Drosofila melanogaster RQIKIWFQRRMKKWK
Фрагмент Tat (47-57) Транскрипционный фактор, участвующий в репликации вируса СПИДа YGRKKRRQRRR
Фрагмент Tat (48-60) Транскрипционный фактор, участвующий в репликации вируса СПИДа GRKKRRQRRRPPQ
VP-22 Вирус-протеин капсида простого герпеса 22 DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE
Пептиды, основанные на сигнальных последовательностях
Kaposi FGF, или пептид, основанный на сигнальной последовательности II Фактор роста фибробластов саркомы Капоши AAVALLPAVLLALLAP
HIV-1 gp-41 Гидрофобный терминальный домен белка gp-41 вируса СПИДа GALFLGFLGAAGSTMGA
Grb2 SH2-домен, src-гомологичный домен 2 AAVLLPVLLAAP
Интегрин α3   VTVLALGALAGVGVG
Химерные и синтетические пептиды
Химерный пептид, основанный на сигнальной последовательности Белок gp-41 вируса СПИДа + область сигнала ядерной локализации(NLS) антигена вируса Simian GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV
Транспортан Галанин + Мастопаран GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL
Амфифильный модельный пептид синтетический KLALKLALKALKAALKLA
KALA InfluenzaHA (hemagglutinin subunit) (1-20) WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALACEA

Интересно, что внутриклеточная локализация интернализуемых пептидов может существенно отличаться. Так, исследование внутриклеточной локализации фрагмента 47-57 из белка tat вируса СПИДа в зависимости от аминокислотного состава показало, что некоторые последовательности преимущественно накапливаются в определенных компартментах клетки. Этот факт создает предпосылки для адресной (например, внутриядерной) доставки функциональных последовательностей.

Наши исследования направлены на изучение механизма антипролиферативной активности химерных пептидов, включающих функциональный фрагмент ингибиторов циклиновых киназ из белков p16INK4a и р21 CIP/KIP и транспортные последовательности Antp, tat, VP22. Мы исследовали изменение свойств химерных пептидов в зависимости от их взаимного расположения, а также от длины векторной конструкции (использовался генно-инженерный вариант Antp). Основные результаты получены при работе на синхронизированных культурах клеток и могут быть суммированы следующим образом:

  • пептидные векторы Аntp и Tat, VP22 накапливаются во внутриклеточном пространстве и могут быть переносчиками как небольших аминокислотных последовательностей, так и последовательностей содержащих более 50 аминокислот;
  • исследование влияния положения векторной последовательности показало, что перемещение ее на N-конец химерной конструкции приводит к снижению функциональной активности пептидов. Показано, что изменение длины полипептидной цепи практически не влияет на функциональную активность пептидов;
  • пептиды, содержащие фрагмент p16INK4a (92-103), вызывают задержку пролиферации клеток в G0/G1 фазах. Содержание клеток в G0/G1 фазах в контроле составляет в среднем 24%, в образцах, инкубированных с pAntp p16 (40мкМ), – 62%;
  • снижение активности циклиновых киназ D–типа под воздействием пептидов, содержащих функциональные фрагменты белка p16INK4a, подтверждается уменьшением уровня фосфорилирования РRb и снижением экспрессии мРНК циклинов;
  • пептиды, содержащие фрагмент р21Cip/Kip, вызывают задержку клеток в S-фазе. Уровень клеток в S-фазе увеличивается до 65% (в контроле – 44%). Количество клеток в G2/M фазах снижается до 0,5% (в контроле – 13%);
  • пептиды, включающие последовательность из p16INK4a, кроме цитостатического обладают и цитотоксическим эффектом, выражающимся в увеличении уровня апоптоза. Средний уровень апоптоза в образцах с пептидами, содержащими фрагмент p16INK4a (40мкМ), увеличивается до 27% (в контроле 10%);
  • интернализуемые пептиды, включающие ингибиторы циклиновых киназ, обладают синергизмом с традиционными противоопухолевыми веществами (этопозид, 5 фторурацил). Комбинация их с паклитакселом приводит к потенцированию цитотоксического эффекта.

Таким образом, как литературные, так и наши собственные данные показывают эффективность предлагаемого нового технологического подхода для целевого воздействия на функции клетки и говорят о перспективности его использования для создания противоопухолевых препаратов, воздействующих на конкретное патологическое звено.