ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ ПРОКЛАДЫВАЮТ ДОРОГУ В КЛИНИКУ
В. Оостерхуис
(Нидерланды)
Введение
Высокопроизводительные аналитические подходы стали возможны благодаря роботизации и миниатюризации лабораторного оборудования работающего под руководством специализированных программ. Хранение и анализ огромного объема информации, полученной в результате работы таких машин, потребовало использования сверхмощных компьютеров и целых компьютерных сетей и разработки программного обеспечения. Без внедрения таких технологий невозможно представить реализацию проекта "Геном человека". В процессе выполнения этого проекта намного ранее запланированных сроков была определена последовательность более 3000 миллионов нуклеотидных последовательностей человеческой ДНК (1). Сведения о строении 35000 генов человека, доступные всем исследователям, служат основой широкомасштабного изучения геномных нарушений, экспрессии различных генов и синтеза белка (http://genome.ucsc.edu). Все эти технологии находят или найдут в ближайшее время свое применение в медицинских исследованиях. Сведения, полученные в ходе сравнительного анализа генома различных растений, животных и человека, помогут определить функциональное значение различных генов и найдут практическое применение в сельском хозяйстве и программе сохранения растительного и животного мира Земли.
Высокопроизводительный анализ геномной ДНК
Сравнительная геномная гибридизация является широко используемым "низко технологичным" методом скринирования последовательностей ДНК, копийность которых в геноме увеличена или уменьшена (2). Смесь одинаковых количеств ДНК, выделенной из опухолевых и контрольных клеток и меченной соответственно красными и зелеными флюорохромами, гибридизируется с метафазами нормальных клеток. Участки генома, копийность которых повышена, выглядят красными, а участки генома, копийность которых ниже нормы, окрашиваются в зеленый цвет. Степень разрешения для утрачивающихся областей генома составляет около 1 млн. пар оснований. Амплификация (повышение копийности) может обнаруживаться и в случае меньшего размера затронутых участков генома при условии ее высокого уровня. Отдельные гены становятся видимыми, если они амплифицированы в 40 и более раз.
При методологии "CGH" смесь ДНК опухолевых и нормальных клеток гибридизируется с панелью клонов ДНК, представляющих разные разведения целого генома или его частей (3). При этом подходе пространственное разрешение значительно выше, что дает возможность идентифицировать отдельные гены в участках генома с повышенной или пониженной копийностью.
Использование панелей ДНК позволяет определять имеющиеся мутации генов, например гена p53, а также нуклеотидный полиморфизм (SNP) (4). Последняя методика используется для поиска молекулярных маркеров в большой популяции или для поиска имеющихся различий в активности энзимов, участвующих в метаболизме (5).
Исследование профилей экспрессии
Недавняя модификация метода "CGH", известная как CESH (Chromosome Expressed Sequence Hybridization - гибридизация экспрессирующихся участков хромосом) является низко разрешающим методом скрининга генной экспрессии (6). Сравнение данных, полученных этим методом, с данными "CGH"-анализа показывает, приводит ли амплификация участков генома к повышенному уровню экспрессии вовлеченных генов, что вовсе не является обязательным.
Большим достижением стало использование микропанелей (micro-arrays), позволяющее изучать уровень экспрессии каждого из генов в тканях и клетках определенного типа или опухолях. Репрезентативные клоны или синтезированные олигонуклеотиды всех или выбранных генов наносятся в виде точек на стекла или микрочипы (7). В случае использования стекол панели затем гибридизируются с кДНК, полученными из мРНК исследуемых тканей/клеток, и одновременно с контрольными кДНК, мечеными соответственно красными и зелеными флюорохромами. Чем выше уровень экспрессии гена в исследуемой ткани, тем сильнее будет представлена в ней кДНК данного гена по сравнению с контролем. Таким образом, после гибридизации сильно экспрессирующиеся гены будут выявляться в виде красных точек, а слабо экспрессирующиеся гены - в виде зеленых точек. Этот метод позволяет в результате одной гибридизации определить профиль экспрессии всех 35000 генов в исследуемой ткани. Так как характеристики и поведение тканей/клеток определяются активностью их генов, профили генной экспрессии могут быть использованы для предсказания поведения опухоли, в частности ее метастатического потенциала и ответа на терапию. Чтобы быть полезными в клинике, профили генной экспрессии должны быть более информативными, чем существующие диагностические и прогностические критерии, такие как клинические характеристики и морфология.
Van 't Veer и соавторы (8) определили уровень экспрессии 25000 генов у больных раком молочной железы с помощью микропанелей Rosetta. Экспрессия была определена у 78 больных спорадическим операбельным раком молочной железы, из которых у 34 отмечено прогрессирование заболевания в течение 5 лет. Выявленная разница в экспрессии отдельных участков ДНК между больными с отдаленными метастазами и без таковых была наиболее значимым прогностическим фактором прогрессирования заболевания, чем стадия, возраст и другие клинические факторы. Из 25000 генов определены 70 генов, экспрессия которых различна в группе больных с прогрессированием болезни и больных, наблюдавшихся без отдаленных метастазов. Данная информация может быть полезна при назначении адъювантной терапии, поскольку достоверно выявляет прогностически благоприятную группу больных, не нуждающихся в адъювантной терапии. В этом же исследовании они сравнили профиль экспрессии различных генов у 78 больных спорадическим раком и у 18 больных раком молочной железы с мутацией генов BRCA1 и 2. Выявлено существенное различие в экспрессии генов между этими двумя группами больных.
Протеомика
Хотя масс-спректрометрия была предложена более 100 лет назад Нобелевским лауреатом сэром Томсоном, только недавно были разработаны спектрометры высокой разрешающей способности и чувствительности, такие как MALDI-tof (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization time-of-flight) (9), используемый в протеомике. При этом небольшое количество (несколько фентамоль) неизвестного белка, полученного с помощью электрофореза, разрушают с помощью трипсина на отдельные фрагменты различной длины и массы. Воздействие на эти фрагменты лазерным излучением высокой энергии приводит к их ионизации и перемещению в вакуумной трубке к детектору. Скорость перемещения фрагмента белка будет зависеть от его массы, и детектор позволяет определить время от начала ионизации до момента достижения детектора. Таким образом, по характеру фрагментов создается масс-спектрометрический профиль изучаемого белка. Для всех известных белков такой профиль уже известен, для неизвестных он хранится в памяти, и для него пытаются найти ген, ответственный за его продукцию. Такой прибор как MALDI-tof масс-спектрометр дает возможность проанализировать сотни образцов белков за один час, что позволяет приблизиться к решению задачи охарактеризовать все белки человеческого организма. В прошлом году инициирован проект "Human Proteom Organization" (HUPO), целью которого является картирование и характеристика всех белков человеческого организма до 2005 г.
Существует множество возможностей прикладного использования протеомики в онкологических исследованиях. Например, путем сравнения картин двумерного электрофореза белков, выделенных из разных опухолей, можно изолировать белки, экспрессия которых закономерно повышается или понижается в клетках определенных новообразований. MALDI-tof позволяет быстро идентифицировать все дифференциально экспрессирующиеся белки, а следовательно дает возможность понять, что именно определяет фенотипические различия, такие как чувствительность к химиотерапевтическим агентам.
Petricoin и соавторы (10) в своей фундаментальной работе показали значение протеомики для диагностики рака яичников. Они сравнили протеомические свойства плазмы больных, страдающих раком яичников и различными доброкачественными образованиями. На основании этих особенностей плазмы удалось правильно определить больных c I стадией рака яичников и тех, кто имеет II-IV стадии. Из 66 больных доброкачественными новообразованиями яичника у 3 был неправильно диагностирован рак яичников. Складывается впечатление, что воспалительные заболевания и доброкачественные опухоли имеют собственные характерные профили экспрессии белков.
Авторы подчеркивают, что разработанный неинвазивный метод диагностики позволяет проводить эффективный скрининг ранних форм рака яичников у носителей мутации BRCA1 and BRCA2. Остается разработать программное обеспечение, которое позволит проводить подобную диагностику (белее подробно смотри www.clinicalproteomics.steem.com). Если данная методика может быть воспроизведена для других форм рака, то тогда изучение протеомики плазмы может быть использовано для ранней диагностики и стадирования злокачественных опухолей.
Банк биологических образцов
Сегодня становится очевидной важность создания коллекций различных опухолей с данными о характере заболевания, лечении и его результатах, а также образцов нормальных тканей и биологических жидкостей здоровых лиц и больных для проведения исследований на основе высокопроизводительных аналитических подходов, упомянутых ранее в этой работе. В нашей лаборатории совместно с EORTC создается виртуальный банк биологических образцов, содержащий имиджи всех известных опухолей человека. Это является одним из примеров создания условия для международного сотрудничества через Всемирную паутину (world wide web). С помощью изучения имиджей становится возможным определение перспективных участков для дальнейшего исследования и последующего запроса на вырезку этого участка из сохраненных блоков опухолей ткани. Первоочередным является создание международных коллекций биологических образцов для проведения совместных исследований.
Тканевые микропанели
Tканевые микропанели (tissue micro-arrays) представляют собой коллекцию микрообразцов нормальных и опухолевых тканей, полученных из сотни или даже тысячи гистологических блоков, для проведения быстрого иммуногистохимического анализа с целью определения экспрессии изучаемого протеина (11). Tканевые микропанели замыкают кольцо, которое мы открыли с изучения генной экспрессии и протеомики. Выявленные с помощью высокопроизводительных аналитических подходов маркеры затем могли бы быть использованы в клинической практике.
Список литературы:
1. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001; 409: 860-921
2. Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Sudar D, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, Pinkel D. Comparative genomic hybridization: a rapid new method for detecting and mapping DNA amplifications in tumors. Semin Cancer Biol 1993; 4: 41-46
3. Kallioniemi OP. Biochip technologies in cancer research. Ann Med 2001; 33: 142-147
4. The international SNP Map Working Group. A map human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature 2001; 409: 928-933
5. Nebert DW, Bingham E. Pharmacogenomics: out of the lab and into the community. Trends Biotechn 2001; 19: 519-523
6. Lu YJ, Williamson D, Clark J, Wang R, Tiffin N, Skelton L, Gord T, Williams R, Allan B, Jackman A, Cooper C, Pritchard-Jones K, Shipley J. Comparative expressed sequence hybridization to chromosomes for tumor classification and identification of genomic regions of differential gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 9197-9202
7. Duggan DJ, Bittner M, Chen Y, Meltzer P, Trent JM. Expression profiling using cDNA microarrays. Nature Genetics 1999; 21S: 10-14
8. Van 't Veer LJ, van de Vijver MJ, He YD, Hart AA, Mao M, Peterse HL, van der Kooy K, Marton MJ, Witteveen AT, Schreiber GJ, Kerkhoven RM, Roberts C, Linsley PS, Bernards R, Friend SH. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002; 415: 530-536
9. Lottspeich F. Proteome analysis: a pathway to the functional analysis of proteins. Angew Chem Int Ed 1999; 38: 2476-2492
10. Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, Mills GB, Simone C, Fishman DA, Kohn EC, Liotta LA. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet 2002; 359: 572-577
11. Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, Barlund M, Schraml P, Leighton S, Torhorst J, Mihatsch, Sauter G, Kallioniemi OP. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med 1998; 4: 844-847
