Материалы конгрессов и конференций

III РОССИЙСКАЯ ОНКОЛОГИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

ПРОБЛЕМЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ

А.Ю. Барышников, Е.В. Степанова
НИИ ЭДиТО ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва

Резистентность больного к проводимой химиотерапии является важной проблемой в онкологии. Резистентность к лекарственным препаратам может быть разделена на несколько больших групп:

    1) фармакокинетическая резистентность (низкая концентрация препарата в опухоли, плохая васкуляризация опухолей, высокое внутриопухолевое давление);
    2) физиологическая резистентность (влияние рН в опухоли);
    3) опухолевая ростовая кинетическая резистентность (низкая фракция делящихся клеток);
    4) клеточная резистентность.

В последнее время большинство исследований сфокусировано на изучении клеточной резистентности. Было обнаружено, что наличие/отсутствие в опухолевых клетках определенных молекулярных маркеров приводит к тому, что опухоли, имеющие одинаковую стадию по классификации TNM, различаются по агрессивности течения заболевания и чувствительности к противоопухолевой лекарственной терапии, что затрудняет выбор оптимального лечения для конкретного больного. Определение таких индивидуальных особенностей опухоли дает возможность планировать лечение онкологического больного в соответствии с ее генетическими характеристиками.

Сейчас активно идет поиск таких маркеров и определение их прогностической и предсказывающей резистентность роли.

Методы определения. Существует две основных группы методов определения биомаркеров:

    1) методы, основанные на определении изменений генов (Нозерн- и Саузерн блоттинги, и более современный метод in situ гибридизации);
    2) методы, основанные на определении экспрессии белков (Вестерн блоттинг, биохимические и иммуногистохимические методы).

В литературе идут большие споры о том, какие из методов лучше, но в последнее время для каждого маркера найдены свои методы, дающие значимую прогностическую информацию. Метод иммуногистохимии считается одним из самых перспективных для оценки экспрессии молекулярных маркеров. К преимуществам этого метода относятся сравнительная простота метода (иммуногистохимия не требует специального оборудования, отсутствующего в патологической лаборатории); возможность работы как на свежезамороженном материале, так и на парафиновых блоках; высокая специфичность (возможность оценить экспрессию маркера именно на опухолевых клетках). К существенному недостатку метода относится пока нестандартизованность методологий различных лабораторий (табл.1).

Таблица. 1
Нерешенные вопросы в методах иммуногистохимии.

- Стандартизация методов; контроль качества.
- Стандартизация антител, используемых для иммуногистохимии.
- Соглашение об общей системе критериев градации и подсчета.
- Адаптация к стандартной системе сообщения.
- Сравнимость результатов, полученных различными методами и лабораториями.

Возможно из-за этих проблем некоторые исследователи не находят прогностической значимости маркеров.

Существует два основных механизма возникновения клеточной лекарственной резистентности:

    1) экспрессия специфических белков, отвечающих за "нейтрализацию" химиопрепарата в опухолевой клетке. К таким белкам относятся Pgp170, MRP, LRP, глутатион-трансфераза П и т.д.;
    2) нарушение механизма гибели клеток под действием химиопрепаратов. К этому механизму относится блокирование апоптоза при мутациях р53, гиперэкспрессии Bcl-2, уменьшение экспрессии CD95 и т.д.;

Первым открытым клеточным насосом на плазматической мембране клеток был продукт гена MDR1 АТФ-зависимый гликопротеин Pgp 170, который ведет к усилению выведения из клеток ряда цитостатиков (антрациклины, винкаалкалоиды, эпиподофиллотоксины, актиномицин D, паклитаксел) по крайней мере in vitro. Pgp 170 уменьшает внутриклеточную концентрацию природных противоопухолевых препаратов путем активного выброса их из опухолевых клеток, создавая таким образом резистентность к этим препаратам. Экспрессия Pgp 170 выше в опухолях, которые произошли из тканей, экспрессирующих Pgp в норме (табл.2). Имеются доказательства, что он играет роль в устойчивости к этим препаратам в гематологических и некоторых солидных опухолях (нейробластомах, мягкотканных саркомах). Так, нами было показано, что Pgp+ лейкозные клетки больных В-ХЛЛ более устойчивы к цитотоксическому действию химиопрепаратов in vitro по сравнению с Pgp170-. Больные хроническим миелоидным лейкозом в стадии бластного криза, чьи бластные клетки экспрессировали Pgp170, имели худший прогноз по сравнению с отрицательными случаями.

Таблица 2.
Экспрессия Pgp 170 при различных типах опухолей.

Высокая экспрессия Средняя экспрессия Низкая экспрессия
Рак почки Рак молочной железы Рак легкого
Гепатоцеллюлярный рак Саркома Меланома
Рак толстого кишечника Рак пищевода Рак простаты
Карциноид Рак желудка Рак мочевого пузыря
Рак поджелудочной железы Глиома Рак головы и шеи
Ретинобластома Нейробластома Рак яичника
Миелома Рак шейки матки Менингиома
  Лимфома Рак щитовидной железы
  Лейкозы Опухоль Вильмса

Определение экспрессии Pgp 170 имеет значение для предсказания резистентности мелкоклеточного рака легкого (МРЛ) к терапии на основе этопозида (табл.3).

Табл. 3
Ответ на химиотерапию на основе этопозида больных МРЛ и экспрессия Pgp 170 (M.Kawasaki)

Ответ на химиотерапию Pgp 170 (+) опухоли Pgp 170 (-) опухоли Вероятность (Р)
Полный и частичный эффект 0 22 0,003
Стабилизация и прогрессирование 4 4  

Недавно были идентифицированы два новых белка, ответственных за лекарственную резистентность - MRP и LRP. Экспрессия MRP связана с экспериментальной резистентностью к цисплатину, винбластину, этопозиду, доксорубицину и другим глутатионовым субстратам. MRP может находиться не только на плазматической мембране, но и на мембранах внутриклеточных органелл в зависимости от типа клеток. Гиперэкспрессия MRP определяется иммуногистохимически в опухолях легкого, детских нейробластомах, колоректальных карциномах (табл.4), не ясна его роль в устойчивости этих опухолей in vivo.

Таблица 4.
Опухоли, с высокой степенью экспрессии MRP

  • рак легкого
  • рак толстого кишечника
  • вторичный острый миелоидный лейкоз
  • детская нейробластома
  • Гиперэкспрессия MRP значимо коррелирует с мутациями р53. Причем, больные немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), имеющие гиперэкспрессию MRP и мутации р53, имели худший прогноз, чем больные без MRP и мутантного р53. Пациенты с MRP-положительными опухолями, получавшие после хирургического вмешательства химиотерапию (виндезин и этопозид), имели более плохой прогноз, чем те, у которых MRP отсутствовал.

    LRP является членом семейства рибо- и нуклеобелков, которые локализуются в цитоплазматических везикулах и ядерных мембранах и его функция связана с перераспределением ксенобиотиков (в частности доксорубицина) из ядра в цитоплазматические везикулы. Исследование роли экспрессии LRP по уровню мРНК методом обратной цепной полимеразной реакции на 14 клеточных линиях рака легкого показало значимую корреляцию с устойчивостью к цисплатину. Однако связи между экспрессией мРНК LRP и устойчивостью к этопозиду, доксорубицину и винкристину не было найдено.

    При исследовании ответа на химиотерапию на основе соединений платины опухолей яичника, только LRP, а не MRP и Pgp 170, был статистически значимым маркером резистентности.

    Сейчас идут активные исследования возможной клинической значимости экспрессии этих белков при различных онкологических заболеваниях.

    Альтернативным механизмом возникновения устойчивости к противоопухолевой терапии является гиперэкспрессия членов семейства изоэнзимов глютатионтрансфераз, которые отвечают за коньюгирование глютатиона с различными ксенобиотиками и могут играть роль в детоксикации. Глутатионтрансфераза П чаще экспрессируется при НМРЛ (около 70%), чем при МРЛ (около 10%). При НМРЛ она является независимым маркером резистентности к терапии на основе цисплатина (табл.5).

    табл.5
    Экспрессия глутатионтрансферазы П (GST) при НМРЛ и ответ на химиотерапию на основе соединений платины (Fen Bai et.al.)

    Ответ на химиотерапию GST (-) GST (+) Вероятность (Р)
    Полный или частичный ответ 9 3 0,0012
    Стабилизация или прогрессирование 4 22  

    Фермент тимидилат синтетаза (ТС) является мишенью для 5-фторурацила (5-FU). ТС катализирует метилирование дезоксиуридинмонофосфата (dUMP) до дезокситимидинмонофосфата (dTMP), который является начальной стадией синтеза ДНК при делении клеток. 5-FU в клетке превращается во фтордезоксимонофосфат, который образует ковалентные комплексы с ТС в присутствии кофакторов (рис.1). ТС является также мишенью для фторпиримидинов, важной группы противоопухолевых препаратов, которые широко используются при лечении желудочно-кишечных опухолей, РМЖ.

    В экспериментах in vitro было показано, что увеличение трансляции или амплификация генов ТС может быть связана с резистентностью к 5-FU. Традиционным методом определения уровня ТС является биохимический, но его применение лимитируется размером образца опухоли. Было показано, что при раке желудка III-IV стадии лечение высокими дозами 5-FU и лейковорина дает эффект только при низкой степени экспрессии ТС в ткани опухоли (табл.6), и медиана общей выживаемости при этом колеблется от 4 месяцев (при высокой экспрессии ТС) до 10 месяцев (при низкой экспрессии) (табл.7).

    Табл.6
    Зависимость ответа на химиотерапию (высокие дозы 5-FU + лейковорин) от экспрессии тимидилат синтетазы у больных раком желудка III-IV стадий (n=30) (Yeh KH et.al.).

    Экспрессия ТС Число ответивших на терапию, n (%) Вероятность (Р)
    Низкая экспрессия 14 (96,7%) * 0,001
    Высокая экспрессия 2 (12%)  

    табл.7
    Зависимость медианы общей выживаемости от экспрессии тимидилат синтетазы у больных раком желудка III-IV стадий (n=30) (Yeh KH et.al.).

    Экспрессия ТС Медиана общей выживаемости (мес.) Вероятность (Р)
    Низкая экспрессия 4 * 0,01
    Высокая экспрессия 10  

    Но если все-таки химиопрепарат попал в клетку и не был "нейтрализован" при помощи перечисленных выше белков, в работу могут вступить другие механизмы возникновения клеточной резистентности. Недавние эксперименты показали, что многие противоопухолевые цитотоксические препараты действуют, запуская апоптоз в клетках-мишенях. Решение о запуске программы клеточной смерти определяется балансом про- и анти-апоптотических сигналов в клетке (рис.2). Сигналы, помогающие клеткам выжить, запускаются контактами "клетка-клетка" и "клетка-экстрацеллюлярный матрикс", а также растворимыми факторами (например, ILGF-1 - инсулиноподобный фактор роста), рецепторами, н-р, HER-2/neu. В качестве примера растворимых про-апоптотических сигналов могут служить лиганды к CD95 и TNF. Внутри клетки решение о смерти определяется частично балансом между молекулами, запускающими апоптоз, подобными bax и анти-апоптотическими молекулами, подобными bcl-2. Повреждения ДНК, определяемые р53 и другими р53-независимыми механизмами, могут индуцировать остановку клеточного цикла в проверочной точке для решения или репарировать ДНК и выжить, или умереть путем апоптоза в зависимости от других про- и анти-апоптотических молекул и сигналов.

    Недавно было показано, что противоопухолевые препараты могут действовать через CD95(Fas/APO-1) рецептор-лигандную систему, индуцируя экспрессию лиганда. Взаимодействие Fas-лиганда с экстрацеллюлярным доменом Fas-рецептора может приводить к его тримеризации и активировать процесс программируемой клеточной гибели. Отсутствие экспрессии CD95 рецептора в опухолевых клетках может приводить к их ускользанию от иммунологического контроля и блокированию запуска апоптоза, вызванного химиотерапией. Экспрессия CD95 рецептора и его связь с прогнозом исхода заболевания плохо изучены в солидных опухолях. Однако, при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) у детей и миелодиспластическом синдроме (МДС) экспрессия рецептора CD95 имеет прогностическое значение. Нами было показано, что у детей больных ОЛЛ с CD95+ бластами медиана 10-летней выживаемости не была достигнута, тогда как в CD95-отрицательной подгруппе этот показатель составил 24 мес. Больные МДС, чьи клетки костного мозга экспрессировали этот антиген, имели лучшую выживаемость по сравнению с больными с CD95-отрицательными клетками.

    Наиболее изученными белками, также участвующими в управлении апоптозом, являются продукты протоонкогена BCL-2 и гена-супрессора опухолевого роста р53.

    Семейство генов BCL-2 возможно играет роль в химиорезистентности через ингибирование апоптоза в опухолевых клетках. Например, оказалось, что уровень BCL-2 в опухолях после химиотерапии у пациентов с устойчивостью к определенным препаратам выше по сравнению с образцами от пациентов, не получавшими до этого терапию. В это семейство входят белки, которые либо ингибируют, либо индуцируют апоптоз (табл.8).

    табл.8

    Белки семейства BCL-2, индуцирующие апоптоз Белки семейства BCL-2, ингибирующие апоптоз
    Bax BCL-2
    BCL-XS BCL-XL
    Bad Mcl-1

    Соотношение про- и анти-апоптотических членов семейства и определяет, подвергнется ли клетка апоптозу. Но прогностическая значимость активно изучается пока только для BCL-2 в силу его более давних исследований.

    Интересно, что BCL-2 оказывает разное влияние на резистентность опухолей к проводимой терапии и прогноз исхода заболевания. В одних типах опухолей экспрессия BCL-2 коррелирует с лучшим прогнозом, в других - наоборот (табл.9).

    табл.9
    Прогностическая значимость экспрессии BCL-2

    Тип опухоли Влияние на прогноз экспрессии Bcl-2
    Неходжкинские лимфомы худший прогноз, резистентность
    РМЖ N0, ER-neg чувствительность к адъювантной терапии тамоксифеном
    Рак яичника лучший прогноз
    НМРЛ лучший прогноз

    BCL-2 является маркером, предсказывающим эффективность адъювантной гормонотерапии. BCL-2 присутствует в нормальной ткани молочной железы и может играть роль в нормальном цикле развития молочной железы. Имеется значимая корреляция между экспрессиями ER, PgR и BCL-2 при РМЖ. Было показано, что BCL-2 может предсказывать эффективность адъювантной терапии тамоксифеном в группе больных РМЖ N+, особенно в группе ER- опухолей.

    р53 - белок, регулирующий прохождение клетки по клеточному циклу. Активность р53 требуется для активации некоторых форм апоптоза, и его мутации могут быть ассоциированы с агрессивностью течения заболевания и устойчивостью опухолевых клеток к химио- или лучевой терапии. Мутации гена р53 - одни из самых распространенных нарушений, которые находят во всех типах опухолей человека и сообщается, что более чем в 50% РЛ является положительным по мутантному р53. Большинство из этих мутаций являются миссенс-мутациями и удлиняют время жизни белка на несколько часов, что делает возможным его определение иммуногистохимическими методами на срезах опухолей. Терапевтический эффект некоторых противоопухолевых агентов связан с повреждением ДНК и уже вторично индукцией апоптоза. В основном, мутации белка р53 выключают функции нормального р53, который останавливает клеточный цикл в G1 или G2 фазе для репарации ДНК. Поэтому мутации р53 могут потенциально обеспечивать генетическую основу устойчивости к химиопрепаратам.

    Прогностическая роль р53 спорна. В части исследований находят связь между р53 и прогнозом, а в части нет. Было замечено что, чем больше выборка больных в исследовании, тем чаще находят прогностическое значение р53 (табл.10).

    табл.10
    Прогностическое значение р53 в зависимости от количества больных в исследуемых группах (Dowell SP).

    Количество больных в исследуемой группе (n) % статей, показывающих прогностическую значимость р53
    * 200 93
    150 - 199 70
    100 -149 56
    50 - 99 57
    * 49 38

    В клинических исследованиях показана значимость определения мутантного р53 при терапии на основе соединений платины при раке яичника (табл.11), НМРЛ (табл.12).

    табл.11
    Корреляция между статусом р53 и ответом на химиотерапию на основе соединений платины у больных раком яичника III-IV стадий (n=32) (SC Righetti) [P=0,002].

    Статус р53 Число больных с полным эффектом Число резистентных больных (включая частичный эффект)
    ИГХ-положительные опухоли 3 16
    ИГХ-отрицательные опухоли 10 3

    табл.12
    Ответ на химиотерапию на основе цисплатина НМРЛ и иммуногистохимический статус р53 (M.Kawasaki)

    Ответ на химиотерапию р53(+) опухоли р53(-) опухоли Вероятность (Р)
    Полный и частичный ответ 2 8 0,004
    Стабилизация или прогрессирование 16 4  

    Гиперэкспрессия на поверхностной мембране опухолевых клеток рецепторов факторов роста является одной из причин неудач в терапии. Так, гиперэкспрессия аналога рецептора эпидермального фактора роста, белка HER-2/neu (с-еrbB-2), придает клеткам свойство неограниченного деления. Введение бестимусным мышам клеток линии рака молочной железы MCF-7 с многочисленными копиями гена HER-2 приводило к значительному увеличению синтеза ДНК, роста клеток, туморогенности и метастатического потенциала. HER-2 называется одним из самых перспективных маркеров для предсказания резистентности к химио- и эндокринотерапии РМЖ (табл.13). Большинство исследований показало возможность использования гиперэкспрессии HER-2 как прогностического фактора при РМЖ.

    Табл.13
    Причины важности определения HER-2/neu при РМЖ

  • HER-2 гиперэкспрессирован в 25-30% РМЖ.
  • Опухоли с гиперэкспрессией HER-2 часто ER-отрицательные и имеют высокую скорость пролиферации.
  • HER-2-положительные опухоли имеют плохой прогноз и укороченную безрецидивную выживаемость.
  • HER-2 - возможный маркер резистентности к субоптимальным дозам химиотерапии на основе антрациклинов.
  • HER-2 - возможный маркер резистентности к химиотерапии по схеме CMF.
  • Белок HER-2 экспрессируется в небольших количествах и в нормальной ткани молочной железы. Было показано, что гиперэкспрессия HER-2 предсказывает плохой прогноз при РМЖ II-III стадий (табл.14), что соответственно требует другого подхода к лечению. Многочисленные исследования показывают, что HER-2 является потенциальным маркером чувствительности к антрациклинам. При HER-2-положительных опухолях более эффективны высокие дозы терапии на основе антрациклинов (CAF) по сравнению с низкими и средними дозами. При химиотерапии по схеме CMF гиперэкспрессия HER-2 коррелировала с плохим ответом (табл.15).

    Табл.14
    Гиперэкспрессия HER-2 предсказывает плохой прогноз при РМЖ II-III стадий.

      HER-2 (+) HER-2 (-)
    5-летняя выживаемость 43% 90%
    10-летняя выживаемость 21,5% 75%

    табл.15
    Гиперэкспрессия HER-2 предсказывает ответ на химиотерапию по схеме CMF.

    Экспрессия HER2 n = % OS P= (log rank)
    Низкая 66 84 0,006
    Высокая 7 42  

    Гиперэкспрессия HER-2 встречается и в других опухолях, особенно раке поджелудочной железы, НМРЛ, простаты, желудка и т.д. (табл.16).

    табл.16
    Гиперэкспрессия HER2 в различных солидных опухолях.

    Тип опухоли Частота гиперэкспрессии
    Рак поджелудочной железы 44 - 68 %
    Рак головы и шеи 46 - 49 %
    Рак желудка 24 -38 %
    Рак простаты 28 %
    Рак толстого кишечника 25 %
    Рак яичника 9 -32 %
    НМРЛ 27 %
    Рак эндометрия 15 - 27 %
    Рак фаллопиевых труб 25 %
    Рак почки 20 %
    Рак шейки матки 14 %

    Показана прогностическая роль гиперэкспрессии HER-2 при аденокарциноме легкого (рис.5), раке поджелудочной железы, желудка, яичника III-IV стадий.

    Рост всех солидных опухолей является ангиогенез-зависимым. Поэтому не удивительно, что оценка ангиогенеза опухоли рассматривается как один из самых успешных маркеров прогноза течения заболевания, наличия метастазов и чувствительности к противоопухолевой терапии. Ангиогенная активность опухоли является сложным балансом между ангиогенными стимулами и природными ингибиторами ангиогенеза.

    В настоящее время оценка ангиогенеза в опухолях проводится путем подсчета количества микрососудов, окрашенных антителами к эндотелиальным клеткам (CD31, CD34, анти-VIII фактор) в поле зрения микроскопа.

    Клиническая значимость определения плотности сосудов в опухоли показана для опухолей различных типов: чем выше плотность сосудов, тем хуже прогноз для пациента. Исследования различных типов опухолей рака легкого, РМЖ, рака яичника и т.д. показывают, что количество сосудов в опухоли коррелирует с прогрессией, наличием метастазов в лимфатические узлы, и отдаленными метастазами.

    Часто формирование новых микрососудов в опухоли отстает от роста самой опухоли, создавая таким образом условия с очень низким содержанием кислорода и питательных веществ, что может лимитировать эффективность химиотерапии. Так, при анализе зависимости плотности сосудов и чувствительности к доксорубицину НМРЛ оказалось, что 85% опухолей с низкой васкуляризацией и 65% с высокой васкуляризацией были резистентны к доксорубицину. Кроме того, гипоксия увеличивает экспрессию генов, связанных с лекарственной устойчивостью (Pgp-гликопротеина, гидрофолат редуктазы). Таким образом, невысокая степень васкуляризации может повышать уровень белков, ассоциированных с устойчивостью, и представлять важный фактор неэффективности химиотерапии и радиации в достижении полной ремиссии.

    Оценка ангиогенеза опухоли N0 может помочь также выделить группы с повышенным риском возникновения метастазов, требующих после оперативного вмешательства адъювантного лечения. При изучении ангиогенеза НМРЛ IIIА (Т1-3N2M0) стадии оказалось, что трехлетняя выживаемость у пациентов с низкой васкуляризацией опухоли не зависела от проведения адъювантной химиотерапии, а с высокой степенью васкуляризации была значительно выше.

    Однако, идентификация биомаркеров, имеющих прогностическое значение, у больных злокачественными заболеваниями, до сих пор остается неполной. Сейчас в нашей лаборатории начаты исследования прогностической роли биомаркеров при разных нозологиях (меланома, рак легкого, РМЖ, рак яичника).