Чердынцева Н.В., Перельмутер В.М., Слонимская Е.М., Литвяков Н.В.,
Стахеева М.Н., Гарбуков Е.Ю., Завьялова М.В., Глущенко С.А.,
Малиновская Е.А., Дорошенко А.В., Красулина Н.А.
НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, Томск
Несмотря на существенные достижения в лечении рака молочной железы (РМЖ) (создание новых лекарственных средств, разработка биотерапевтических подходов, позволяющих повысить специфичность воздействия, и др.), результаты далеко не всегда удовлетворительны. Более 70% первично выявляемых больных РМЖ нуждаются в том или ином варианте адъювантной терапии, поскольку показано, что ее применение на 30-40% снижает уровень ожидаемой смертности (Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group, 1998). Адъювантная химио- или гормонотерапия предлагается больным с низким, умеренным и высоким риском рецидива или диссеминации, т.е. прогностически гетерогенной группе пациентов, при этом выигрыш в эффективности для больных с благоприятным прогнозом не превышает 5%. Таким образом, хотя адъювантная системная терапия приводит к определенному улучшению прогноза, многие больные подвергаются неблагоприятному воздействию в результате «сверхлечения», которого можно было бы избежать при более точном прогнозе заболевания (Bergh J & Holmquist M., 2001, Ginsburg G. & McCarthy J., 2001).
В значительной мере неудовлетворительная точность прогнозирования обусловлена тем, что использование стандартных прогностических и предсказательных критериев далеко не всегда позволяет с высокой степенью вероятности оценить риск прогрессирования заболевания у отдельного больного и, следовательно, определить план индивидуальной тактики лечения. Традиционно определение тактики лечения больных РМЖ производится на основании клинических и морфологических характеристик опухолевого процесса. Несмотря на то, что распространенность опухолевого процесса является наиважнейшим критерием прогноза и выбора тактики лечения, далеко не всегда выявляется ее корреляция с эффективностью лечения и исходом болезни. В последнее время в перечень критериев прогноза включен ряд молекулярных маркеров опухолевых клеток. Однако, несмотря на доказанную прогностическую значимость степени экспрессии РЭ и РП, Her2-neu и ряда других маркеров, определение индивидуального прогноза заболевания при РМЖ остается большой проблемой. Это делает актуальным разработку новых независимых прогностических и предсказательных критериев. Можно предполагать, что высокоинформативные маркеры существуют, но пока не найдены. Однако, исходя из мультифакториальной природы РМЖ и многообразия механизмов, обеспечивающих развитие прогрессии, вряд ли резонно полагать, что можно найти высокоспецифичные маркеры, одинаковые для всех больных РМЖ вообще. Можно пойти другим путем и обосновать выделение групп больных РМЖ, для которых известные признаки позволяют делать с высокой вероятностью индивидуальный прогноз. Мы предлагаем подход, который мог бы повысить информативность уже известных и вновь предлагаемых факторов оценки прогноза. Решение проблемы может быть в определении таких дискриминирующих признаков, по которым можно относить больных к разным высокооднородным внутри группам.
В основе такого подхода лежит представление о том, что РМЖ, как и другие опухоли, разнообразен по вариантам проявления злокачественности, и общепринятое деление по стадиям приводит к объединению в одну группу случаев с разными биологическими потенциями опухолевых клеток, определяющих их способность к прогрессии. Еще в конце 60-х годов ХХ века было сформулировано правило о независимости развития разных форм прогрессии (Foulds, 1969). Разные варианты прогрессии могут иметь общие механизмы, но различаться по своим сущностным свойствам, отражающим их злокачественный потенциал. В этой связи представляется, что перспектива улучшения результатов терапии РМЖ может быть связана с более четкой типологической классификацией вариантов опухолевой прогрессии, основанной на определении важнейших молекулярно-генетических маркеров опухолевых клеток и организма хозяина, включая наследственно-обусловленные, с тем, чтобы более эффективно оценить биологические потенции опухоли у того или иного больного.
Прогрессия опухоли, означающая процесс возникновения и отбора более злокачественных клонов и клинически манифестируемая в виде автономизации роста, лимфогенного или гематогенного метастазирования, рецидивирования, с одной стороны, определяется биологическими свойствами опухолевых клеток, с другой – может модулироваться различными факторами организма.
В настоящее время нет четких представлений о механизмах опухолевой прогрессии в связи с неоднозначностью результатов исследований различных авторов. Классические представления о клональной эволюции опухоли, согласно которой в результате отбора в первичной опухоли появляется клон клеток, дающий начало отдаленным метастазам, имеют свое генетическое подтверждение (Bernards R & Weinberg RA., 2002). В то же время подтверждается возможность появления на поздних этапах роста опухоли клеток с особыми специфическими генетическими изменениями, которые ответственны за отдаленное метастазирование (Shiseki M et al, 1994, 1996). На сегодняшний день нет четких данных о времени появления метастатического фенотипа и вовлекаемых в его формирование генов при злокачественных новообразованиях молочной железы, а следовательно, и ранних прогностических признаков метастазирования. Так, генетический анализ отдаленных микрометастазов РМЖ показал, что опухолевые клетки диссеминируют очень рано и вовлекаются в метастатическую болезнь независимо от первичной опухоли (Schmidt-Kittler O, 2003). Gray J. было выявлено, что генетические изменения в опухолевых клетках, метастазирующих в костный мозг пациентов, у которых генерализация процесса клинически не проявлялась, отличаются от изменений в клетках первичной опухоли, что позволяет говорить о параллельной эволюции опухоли и метастазов (Gray J., 2003). Все это свидетельствует о высокой гетерогенности опухолевых фенотипов, определяющих особенности прогрессии у разных индивидуумов, и предполагает наличие различных молекулярно-генетических изменений, обуславливающих ее специфику (Yokota J & Kohno T., 2004, Celis E. et al, 2005, Lichtenstein A., 2005, Thiagalingam S., 2006). Одной из иллюстраций, хорошо знакомой клиницистам, является такое развитие событий, когда неоадъювантная химиотерапия вызывает выраженную инволюцию первичной опухоли, но неэффективна в отношении микрофокусов роста и лимфогенных метастазов.
Таким образом, вышесказанное может служить подтверждением того, что различным вариантам опухолевой прогрессии присущи различные биологические фенотипы, определяющие прогноз. Поэтому не подлежит большому сомнению, что для разных форм прогрессии могут быть информативными разные маркеры. В этой связи перспективен поиск высокоспецифичных дискриминирующих маркеров, позволяющих предсказать то или иное сочетание форм прогрессии у каждого больного. Это позволит более эффективно управлять процессом прогрессии, не ограничиваясь использованием лишь прямых цитодеструктивных воздействий.
В качестве дискриминирующих критериев при поиске факторов индивидуального прогноза предлагается использовать в первую очередь форму прогрессии и вариант морфологического фенотипа опухоли.
Согласно полученным нами данным, у 30% больных РМЖ при гистологическом исследовании обнаружено скрытое течение мультифокального/мультицентрического роста опухоли в молочной железе с наличием множества микрофокусов роста при наличии одного клинически выявляемого узла. Здесь следует особо отметить, что мировая статистика мультицентрических раков (2-60%) не выделяет отдельно клинически выявляемые опухоли и микрофокусы (Керимов Р.А., 2006). В наших исследованиях мультифокусный рост составил 10%, тогда как микрофокусы были обнаружены у 30% больных. Есть основания полагать, что мультицентрический (клинически не выявляемый) рост опухоли может рассматриваться как одна из форм проявления злокачественности, а следовательно, может быть классифицирован как один из вариантов опухолевой прогрессии.
Поскольку более 80% всех больных имеют инфильтрирующий протоковый рак, мы акцентировали внимание на вариантах морфологического строения инфильтративного компонента, отражающих гетерогенность опухоли. Наличие микроальвеолярных (МА) структур в инфильтративном компоненте тесно взаимосвязано с более высокой частотой лимфогенного метастазирования. Отмечено, что с увеличением количества МА увеличивается вероятность лимфогенного метастазирования у женщин в постменопаузальном периоде. Выделен гистологический вариант инфильтративного компонента РМЖ, тесно связанный с вероятностью мультифокального/мультицентрического роста опухоли и лимфогенного метастазирования. Прицельное изучение молекулярно-генетических характеристик этих структур позволит уточнить фенотип лимфогенного метастазирования. Установлено, что морфологические параметры в центральных и периферических отделах первичной опухоли, включая гистологическое строение протокового и инфильтративного компонентов, выраженность воспалительной инфильтрации стромы, имеют существенные различия, сопряженные с частотой и выраженностью лимфогенного метастазирования – важнейшего атрибута опухолевой прогрессии.
Морфологические проявления, по сути, представляют интегральное отражение опухолевого фенотипа, который является результирующей биологических свойств как собственно опухоли, так и регуляторных влияний со стороны организма.
Молекулярной основой поведения опухолевых клеток, определяющего свойства и скорость прогрессии, могут выступать следующие условия:
В настоящее время выявлено множество генетических и эпигенетических нарушений, сопряженных с РМЖ, сведения о которых исчерпывающе представлены в целом ряде обзоров (Imyanitov E & Hanson K, 2004, Natanson K. et al, 2001). Известны молекулярно-генетические маркеры, которые обладают определенной прогностической значимостью, среди них наиболее изученными являются амплификация онкогенов ERBB2 (HER2, C-MYC, CCND1), мутации в гене онкосупрессоре р53, в онкогенах семейства RAS, постоянно увеличивается число генов, для которых установлено снижение транскрипционной активности при РМЖ (Lerebours F. & Lidereau R., 2002). Различные комбинации активирующих и инактивирующих мутаций и эпигенетических событий определяют спектр свойств опухолевых клеток (фенотип). Наиболее важным в плане прогрессии является чувствительность к аутокринным факторам роста наряду с резистентностью к антипролиферативным сигналам, иммортализация, избегание апоптоза, инвазия, метастазирование, геномная нестабильность, ангиогенез. Особо следует отметить существенное влияние факторов микроокружения опухоли на прогрессию (Imyanitov E & Hanson K, 2004).
Экспериментальное подтверждение участия многих молекулярных факторов в опухолевой прогрессии проведено путем создания условий для сверхэкспрессии или, напротив, блокирования функций того или иного гена (или его продукта) и оценки их влияния на опухолевый процесс. Данные клинико-эпидемиологических исследований о значимой связи изучаемого маркера с клиническими проявлениями прогрессии и исходом заболевания также можно рассматривать как свидетельство патогенетической связи изучаемых факторов с опухолевой прогрессией.
Принимая во внимание плейотропность генетических взаимоотношений, молекулярную мультимодальность и дублирование внутриклеточных каскадов сигнальных путей, можно уверенно полагать, что одинаковые повреждения генов могут иметь совершенно разные эффекты, что определяется тканевой специфичностью, сочетанием повреждений, а также уже предсуществующими изменениями в клетках-мишенях, которые обусловлены генетическим полиморфизмом (Thiagalingam S., 2006). Не вызывает сомнений, что одной из причин вариабельности механизмов опухолевой прогрессии является наличие конституционального (врожденного) генетического полиморфизма (Hunter K. & Crawford N., 2006, Spitz M. et al, 2005). В частности, ярким примером подтверждения предположения, что метастазирование не является просто соматическим процессом эволюции клеток опухоли, служат результаты экспериментальных исследований на инбредных мышах, у которых развивалась спонтанная высоко агрессивная метастазирующая MMTV-PyMT вирус зависимая опухоль. Скрещивание этих мышей с мышами ряда других трансгенных штаммов приводило к появлению у таких гибридов существенных различий в частоте развития метастазов, однако при этом не было изменений в инициации и кинетике роста первичной опухоли (Lifsted T., 1998). Вполне очевидно, что сформировавшийся манифестируемый метастатический фенотип является результатом функционирования множества полиморфных генов во взаимодействии с внешними факторами.
Как уже упоминалось выше, клетки стромы опухоли, включая лейкоцитарные и лимфоцитарные элементы, также претерпевают генетические изменения, способствующие опухолевой прогрессии, и их спектр различен у разных индивидуумов. Значительные функциональные вариации стромальных клеток в результате аллельного полиморфизма в микроокружении первичной или вторичных опухолей могут вносить существенный вклад в процесс метастазирования. Одним из подтверждений этого могут служить данные о том, что вариантные аллели генов ряда воспалительных цитокинов и их рецепторов ассоциированы с риском возникновения и прогрессией РМЖ (Azmy I. et al, 2004, Smith K.et al., 2005). Таким образом, аллельные вариации генов могут играть важную роль в характере опухолевого роста, препятствуя или способствуя опухолевой прогрессии. Не исключено, что в будущем идентификация полиморфизмов конечного числа генов с максимальной прогностической ценностью может существенно повысить вероятность индивидуального прогноза (Hunter K. & Crawford N., 2006).
Особое место в картине нарушений при РМЖ занимают повреждения генов, локализованных на 17 хромосоме, в частности, гена онкосупрессорного белка p53, который регулирует экспрессию генов ингибиции клеточного цикла, промоции апоптоза, контроля геномной стабильности и ингибиции ангиогенеза (Vogelstein B. et al., 2000). Установлено, что полиморфизм в 72 кодоне 4 экзона, отвечающего за структурное взаимодействие р53 белка с поврежденной ДНК, в результате однонуклеотидной замены гуанина (G) на цитозин (C) (CGC - аргинин, CCC – пролин) ведет к замене аргинина на пролин в первичной структуре белка р53. Выявлено, что аргинин и пролин обладают разной способностью к активации транскрипции и к взаимодействию с молекулами активации транскрипции регуляторных генов, а также с внешними факторами, что определяет особенности реакции апоптоза и предполагает возможное влияние аллельных вариантов р53 на предрасположенность к онкологической патологии и опухолевую прогрессию (Thomas M. et al, 1999).
Arg/Pro полиморфизм затрагивает SH3 связывающий участок, который кодирует JNK (c-Jun NH2-terminal kinase) фосфолирирующий сайт. JNK сайт 4 экзона необходим для передачи сигналов, поступающих от протеинов, которые регулируют инициацию транскрипции посредством МАР-киназ (mitogen-activated protein kinase). Хемокиновый рецептор CCR5 регулирует инициацию транскрипционной активности р53, участвуя в цепи передачи внутриклеточного сигнала через JAK2 (Janus kinase) или р38 МАР-зависимый путь активации киназ. Однонуклеотидная замена, находящаяся вблизи сайта связывания SH3 и активации транскрипции гена р53, ведет к синтезу белка с измененной чувствительностью к поступающим от хемокинового рецептора ССR5 сигналам (http://sciencepark.mdanderson. org/cmgcc/models.html#model-2).
Manes S. et al. в 2003 году установлено, что для осуществления эффективного апоптоза модифицированных клеток необходимо согласованное взаимодействие белка-рецептора CCR5 и р53. При этом у пациенток с РМЖ, имеющих мутантный аллель CCR5del и неповрежденный р53 в клетках опухоли, отмечены более низкие показатели безрецидивной выживаемости по сравнению с теми, кто имел CCR5 без делеционных изменений (Manes S et al, 2003). Авторы связывают это с нарушением передачи апоптоз-индуцирующего сигнала трансформированным клеткам. Хемокиновый рецептор ССR5 весьма многофункционален по своим свойствам, участвует также в иммунных реакциях и экспрессируется воспалительными и опухолевыми клетками (Azenshtein E. et al.2002). Ранее нами выявлена ассоциация мутантного аллеля del 32 CCR5 с прогрессированием у больных раком легкого (Чердынцева и соавт., 2003).
В течение ряда лет мы проводили изучение информативности целого комплекса патогенетически значимых при РМЖ молекулярно-генетических факторов, в том числе р53, ССR5, интерлейкинов в качестве дополнительных критериев прогноза заболевания. Обследованы 250 больных РМЖ, получавших лечение в клинике НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, которое включало предоперационную химиотерапию, операцию и послеоперационную химиотерапию.
Мы оценили связь полиморфных вариантов гена онкосупрессора р53 и функционально связанного с ним гена хемокинового рецептора ССR5 и их сочетаний с риском прогрессирования РМЖ. У женщин со злокачественными новообразованиями молочной железы сочетание нормальных генотипов ССR5 и р53 (4 экзон) ассоциировано с более высокой вероятностью лимфогенного метастазирования, и напротив, наличие в генотипе ССR5del32 существенно ее снижает. Более злокачественный фенотип опухоли и худший прогноз ассоциирован с Arg/Arg и Arg/Pro генотипами р53, при этом гетерозиготы по минорному аллелю Pro характеризовались умеренной злокачественностью опухоли и благоприятным клиническим течением заболевания.
Были проведены исследования, направленные на выявление независимых факторов, значимо связанных с тем или иным клиническим проявлением опухолевой прогрессии, с использованием логистического регрессионного анализа. В качестве группирующих переменных (форм прогрессии) мы выбрали лимфогенное метастазирование, размер первичной опухоли, мультицентрический характер роста опухоли с учетом макро и микрофокусов, а также исход заболевания.
Была определена продукция целого ряда патогенетически значимых цитокинов и других иммунологических параметров, однако оказалось, что лишь высокий уровень продукции ИЛ-4 и спонтанной пролиферации лимфоцитов связаны с неблагоприятным исходом. Интересно при этом, что более высокий уровень продукции ИЛ-4 не ассоциирован с лимфогенным метастазированием, что косвенно свидетельствует о различных путях вовлечения ИЛ-4 в процессы лимфогенного и гематогенного метастазирования.
Мы не выявили значимой связи изучаемых показателей с размером первичной опухоли (Т1-Т4) в общей группе больных, однако для женщин в постменопаузальном периоде была прослежена тенденция связи генотипа CCR5 со значением Т.
Информативным показателем, тесно связанным с лимфогенным метастазированием, оказалось сочетание генотипов р53 и CCR5. Выявлена также его связь с мультицентрическим характером роста опухоли. Эти данные свидетельствуют в пользу определенной сходности опухолевых фенотипов, сопряженных с лимфогенным метастазированием и мультицентрическим характером роста опухоли. При этом на размер опухоли этот показатель не влиял. Связь сочетания генотипов р53 и CCR5 с неблагоприятным исходом была выявлена только для женщин, находящихся в постменопаузе.
Полученные нами предварительные данные свидетельствуют о разной прогностической значимости исследованных параметров для разных форм проявления опухолевой прогрессии, т.е. эти признаки не универсальны, а сопряжены с разными формами прогрессии.
Таким образом, на основании современных представлений о независимости различных вариантов опухолевой прогрессии, мультимодальности вовлекаемых в нее молекулярно-генетических механизмов и собственных данных о разной прогностической значимости исследованных факторов при разных формах прогрессии, мы полагаем, что для повышения точности индивидуального прогнозирования необходимо и возможно обозначить группы биологических признаков, от морфологических до молекулярно-генетических, которые в максимальной степени были бы сопряжены с определенными формами опухолевой прогрессии. Такая типологическая классификация позволит более четко определять индивидуальный прогноз и назначать адекватную тактику лечения.
Работа поддержана 3 грантами Российского общественного фонда содействия отечественной медицине.
Авторы выражают благодарность члену-корреспонденту РАМН М.И. Воеводе и доктору биологических наук В.А. Белявской за помощь в проведении молекулярно-генетических исследований.
Список литературы:
1. Керимов Р.А. Мультицентрический рак молочной железы: особенности течения, результаты терапии, прогноз. Маммология, 2006; 2: 32-36.
2. Azenshtein E., Luboshits G., Shina S. et al The CC Chemokine RANTES in breast carcinoma progression Cancer Res 2002; 62: 1093-1102.
3. Azmy I., Balasubramanian S., Wilson A. et al Role of tumor necrosis factor gene polymorphisms (-308 and -238) in breast cancer susceptibility and severity. Breast Cancer Res 2004; 6: 395-400.
4. Bergh J and Holmquist M. Who should not receive adjuvant chemotherapy? International databases. J Natl Cancer Inst Monogr 2001; 30: 103–108.
5. Bernards R, Weinberg RA. A progression puzzle. Nature 2002; 418: 823.
6. Celis J, Moreira J, Gromova I et al. Towards discovery-driven translational research in breast cancer. FEBS Journal 2005; 272: 2–15.
7. Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group. Tamoxifen for early breast cancer: an overview of the randomized trials. Lancet 1998; 351: 1451–1467.
8. Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group. Polychemotherapy for early breast cancer: an overview of the randomized trials. Lancet 1998; 352: 930–942.
9. Ginsburg GS, McCarthy JJ: Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. Trends Biotechnol 2001; 19: 491-496.
10. Gray JW. Evidence emerges for early metastasis and parallel evolution of primary and metastatic tumors. Cancer Cell 2003; 4: 4–6.
11. Hunter K. and Crawford N. Germ line polymorphism in metastatic progression. Cancer Res 2006; 66 (3): 1251-54.
12.http://sciencepark.mdanderson.org/cmgcc/models.html#model-2).
13. Imyanitov E and Hanson K. Mechanisms of breast cancer. Drug discovery today: disease mechanism, 2004; 1 (2): 235-245.
14. Lerebours F. and Lidereau R. Molecular alteration in sporadic breast cancer. Crit Rev Oncol Hematol 2002; 44: 121-141.
15. Lichtenstein A. On evolutionary origin of cancer. Cancer Cell Int, 2005; 5(1): 5.
16. Lifsted T, Le Voyer T, Williams M, et al. Identification of inbred mouse strains harboring genetic modifiers of mammary tumor age of onset and metastatic progression. Int J Cancer 1998; 77: 640–4.
17. Manes S., Mira E., Colomer R. et al. CCR5 expression influences the progression of human breast cancer in a p53-dependent manner. J Exp Med 2003; 198: P.1381–1389.
18. Natanson K. et al. Breast cancer genetic: what we know and what we need. Nat. Med, 2001; 7: 552-556.
19. Schmidt-Kittler O, Ragg T, Daskalakis A et al. From latent disseminated cells to overt metastasis: genetic analysis of systemic breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 7737–42.
20. Shiseki M, Kohno T, Nishikawa R et al. Frequent allelic losses on chromosomes 2q, 18q and 22q in advanced nonsmall cell lung carcinoma. Cancer Res 1994; 54: 5643–8.
21. Shiseki M, Kohno T, Adachi J et al. Comparative allelotype of early and advanced stage non-small cell lung carcinomas. Genes Chromosom Cancer 1996; 17: 71–7.
22. Smith K. et al. Cytokine gene polymorphism and breast cancer susceptibility and prognosis. Eur J Immunogenet 2004; 31(4): 167-73.
23. Spitz M, Wu X and Mills G. Integrative Epidemiology: From Risk Assessment to Outcome Prediction. J Clin oncol 2005; 23 (2): 267-275.
24. Thiagalingam S. A Cascade of Modules of a Network Defines Cancer Progression. Cancer Res 2006; 66 (15): 7379-85
25. Thomas M., Kalita A., Labrecque S. et al. Two polymorphic variants of wild-type p53 differ biochemically and biologically. Mol Cell Biol 1999; 19: 1092–1100.
26. Vogelstein B, Lane D, Levine AJ. Surfing the p53 network. Nature 2000; 408: 307–10.
27. Yokota J and Takashi K. Molecular footprints of human lung cancer progression. Cancer Sci 2004; 95 (3): 197–204.
