Материалы конгрессов и конференций

IX РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОЛИФЕРАЦИИ РАКОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
С ПОМОЩЬЮ siРНК

Е.Л. Черноловская, Т.О. Кабилова, А.В. Владимирова, В.В. Власов
ИХБФМ СО РАН, Новосибирск

Гены семейства myc (c-myc, N-myc и L-myc) участвуют в контроле клеточной пролиферации, дифференцировки и канцерогенеза. Транскрипционные факторы myc являются привлекательной мишенью для гено-терапии поскольку расположены функционально в начале регуляторных каскадов, и их гиперэкспрессия и/или нарушение регуляции имеют место в большинстве опухолей (Spencer C.A. & Groudine M., 1991, Adv. Cancer Res. 56, 1-48). Таким образом, подавление функции генов myc будет оказывать влияние на рост опухолей, характеризующихся целым рядом генетических аномалий, таких как амплификация, хромосомные транслокации, вирусные инсерции и мутации в кодирующих и регуляторных районах, которые приводят к усилению экспрессии генов (Nesbit C.E., Tersak J.M. & Prochownik E.V., 1999, Oncogene, 18, 3004-3016).

Амплификация генов myc была обнаружена в целом ряде опухолей (рак груди, рак легких, нейробластомы), но наиболее часто усиление экспрессии myc генов не сопровождается амплификацией (Sabichi A.L. & Birrer M.J., 1996, Regulation of nuclear oncogenes expressed in lung cancer cell lines. J. Cell. Biochem. Suppl. 24, 218-227). Во многих случаях причины такой гиперэкспрессии неизвестны. Одной из частых причин усиления экспрессии генов myc являются мутации в промоторном районе, которые приводят к нарушению регуляции его экспрессии (Grand C.L., Powell T.J., Nagle R.B., Bearss D.J., Tye D., Gleason-Guzman M. & Hurley, L.H., 2004, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 101, 6140-6145).

Другим механизмом усиления экспрессии является стабилизация myc мРНК за счет добавления или потери последовательностей в 3’- или 5’-нетранслируемом районе (Bernasconi N.L., Wormhoudt T.A. & Laird-Offringa I.A., 2000, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 23, 560-565).

Нарушение регуляции экспрессии генов myc (N-myc и/или c-myc) играют ключевую роль в развитии нейробластом - неоплазии, наиболее часто встречающейся у детей. Эти опухоли часто обладают устойчивостью к альфа-интерферону и ретиноевой кислоте (Reynolds C.P., et al., 2000, Med. Pediatr. Oncol. 35, 597-602; Lippman S.M., et al., 1993, Eur. J. Cancer, 5, 9-13), которые ингибируют пролиферацию и индуцируют дифференцировку. Было показано, что индукция дифференцировки в клетках нейробластомы человека с помощью 12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (TPA) сопровождается быстрой временной активацией экспрессии гена c-fos и снижением уровня мРНК гена c-myc (Hammerling U., et al., 1987, Oncogene, 2, 73-77). Идентификация специфических ингибиторов генов myc является важным этапом разработки препаратов для лечения лекарственно-устойчивых нейробластом. Антисмысловые олигонуклеотиды, направленные против генов c-myc (Pastorino F., Stuart D., Ponzoni M. & Allen T.M., 2001, J. Control Release, 74, 69-75) и N-myc (Galderisi U., et al., 1999, J. Cell. Biochem. 73, 97-105) интенсивно исследовались в качестве антипролиферативных агентов, однако достигнутые уровни ингибирования, необходимость использовать высокие концентрации олигонуклеотидов и вызываемые нуклеазоустойчивыми аналогами побочные эффекты делают проблематичным их использование в медицине.

Исследование механизмов регуляции активности генов в последние годы привело к обнаружению нового механизма подавления экспрессии генов – РНК-интерференции, заключающейся в способности двуцепочечной РНК (дцРНК) вызывать специфическую деградацию мРНК мишени, последовательность которой комплементарна одной из цепей дцРНК. Длинные дцРНК, попадая в клетку, подвергаются эндонуклеазному расщеплению на короткие, длиной 19-21 п.н., двуцепочечные фрагменты (P.D. Zamore, et al., 2000, 101, 25) с двумя выступающими нуклеотидами на 3’ концах цепей. Эти короткие дуплексы, получившие название siРНК (short interfering RNAs, малые интерферирующие РНК), в составе комплекса с белками образуют каталитические структуры, вызывающие направленную деградацию комплементарной им мРНК-мишени. В настоящее время РНК-интерференция активно используется для регуляции экспрессии генов и как метод изучения функциональной геномики эукариот.

Механизм РНК-интерференции в клетках млекопитающих может быть запущен с помощью коротких синтетических РНК-дуплексов – siРНК (S.M. Elbashir, W. Lendeckel, and T. Tuschl, Genes Dev., 2001, 15, 188.). Было показано, что siРНК проявляют активность в чрезвычайно низких концентрациях, и с их помощью можно эффективно подавлять экспрессию определенных генов.

Мы использовали siРНК для подавления экспрессии гена c-myc в клетках карциномы и нейробластомы человека и исследовали влияние этого подавления на скорость пролиферации этих клеток.

Для исследования способности c-myc siРНК ингибировать экспрессию гена myc и пролиферацию раковых клеток мы использовали 21 п.о. siРНК-I с 3’ выступающими уридиновыми динуклеотидами, гомологичную последовательности (1452-1470) иРНК гена c-myc. siРНК-K, гомологичная последовательности 1 интрона гена MDR1, была использована в качестве контроля. siРНК дуплексы были получены путем in vitro транскрипции с помощью T7 РНК полимеразы на коротких ДНК-матрицах по протоколу Ambion с некоторыми модификациями (http://www.ambion.com/techlib/tn/103/2.html). В качестве модели мы использовали клеточные линии эпидермоидной карциномы человека (KB-3-1) и нейробластомы (SK-N-MC), которые характеризуются повышенным уровнем экспрессии мРНК гена c-myc. IMR-32 клетки с повышенным уровнем мРНК гена N-myc, но не c-myc, использовали в качестве контроля.

Для исследования влияния действия siРНК на уровень c-myc мРНК различные количества siРНК-I и siРНК-K трансфецировали в клетки KB-3-1 и SK-N-MC с помощью олигофектамина и определяли уровень c-myc мРНК через 48 ч методом RT-PCR, используя в качестве внутреннего стандарта мРНК гена бета-микроглобулина. Полученные данные показали, что siРНК-I вызывает концентрационно зависимое снижение уровня c-myc мРНК в обеих клеточных линиях. Однако эффективность действия siРНК-I была существенно выше в клетках KB-3-1 по сравнению с клетками SK-N-MC: так, инкубация клеток с 200 нM siРНК-I приводила к снижению уровня c-myc мРНК до 8% от исходного в клетках KB-3-1 и только до 40% в клетках SK-N-MC. Изменения уровня мРНК гена c-myc в клетках, подвергнутых действию различных концентраций контрольного дуплекса siРНК-K или только трансфекционного агента не наблюдалось. Увеличивающиеся концентрации (25-400 нM) химически синтезированного siРНК-I той же последовательности, так же как и полученного ферментативно, вызывали более слабое снижение уровня c-myc мРНК (до 35% от контроля при использовании siРНК в концентрации 400нМ).

Для исследования длительности эффекта подавления экспрессии после единичной обработки siРНК-I мы исследовали кинетику изменения уровня мРНК гена c-myc. Клетки KB-3-1 трансфецировали 200 нM siРНК-I с помощью олигофектамина и определяли уровень c-myc мРНК через определенные промежутки времени. Полученные данные показали, что 200 нM siРНК-I снижает уровень c-myc мРНК до 72% от исходного уже через 1 день после трансфекции. Через 2–4 дня после трансфекции в клетках наблюдается минимальный уровень c-myc мРНК (9–14% от уровня мРНК в контрольных клетках, обработанных только олигофектамином). К 5 дню уровень c-myc мРНК несколько возрастает, достигая исходного уровня через 12 дней после трансфекции. Исследование показало, что ингибирование происходит в течение достаточно продолжительного времени, и сниженный уровень мРНК поддерживается на протяжении нескольких дней. Возможно, последовательные обработки препаратом с 5-дневными интервалами позволят поддерживать низкий уровень экспрессии этого гена в течение необходимого времени.

Недавно было показано, что даже кратковременное ингибирование экспрессии гена c-myc останавливает рост опухоли, а его реактивация вызывает апоптоз и регрессию опухоли (Jain M., et al., 2002, Science, 297, 102-104; Bazarov A.V., et al., 2001, Cancer Res. 61, 1178-1186). Таким образом, полученные данные показывают, что уменьшающие активность c-myc интерферирующие РНК могут препятствовать опухолевой прогрессии и даже вызывать регрессию опухолей.

Мы попытались понять, каким образом снижение уровня мРНК гена c-myc влияет на скорость пролиферации раковых клеток. Для этого мы определяли изменение количества живых клеток после инкубации с siРНК-I с помощью МТТ теста. Исследование пролиферации проводилось на клетках линий KB-3-1, SK-N-MC и IMR-32. Эксперимент проводили следующим образом: клетки в 96 планшете трансфецировали с помощью олигофектамина увеличивающимися количествами siРНК-I и определяли количество живых клеток с интервалом 24 ч (1-6 дни). Относительное количество исходных клеток принимали за 1. Полученные данные показали, что действие 200 нМ siРНК-I приводит к 15-кратному снижению скорости пролиферации клеток КВ-3-1 через 4 дня после трансфекции, а 400 нМ siРНК-I вызывало полную остановку роста.

Антипролиферативное действие siРНК-I на клетки SK-N-MC было менее выраженным: 2,5-кратное снижение скорости пролиферации наблюдалось через 4 дня после трансфекции, повышение концентрации до 400 нM не приводило к существенному усилению эффекта (3-кратное ингибирование роста). Данные МTT теста коррелировали с уровнем мРНК гена c-myc, определенному с помощью RT-PCR. Это означает, что степень снижения уровня мРНК напрямую определяет эффективность ингибирования роста клеток. Отсутствие влияния siРНК-I на скорость роста клеток IMR-32 демонстрирует, что данные siРНК не вызывают неспецифических антипролиферативных или интерферон-индуцирующих эффектов.

Для выяснения причины разной эффективности подавления экспрессии гена c-myc с помощью siРНК-I в клетках KB-3-1 и SK-N-MC мы исследовали способность флюоресцентно меченного аналога siРНК-I проникать в исследуемые клеточные линии в присутствии и отсутствии трансфектанта. Количественные данные, полученные путем обработки изображений клеток с помощью флюоресцентного микроскопа с CCD-камерой, показали, что в отсутствии олигофектамина siРНК-I накапливалась только в клетках SK-N-MC (3-кратное превышение сигнала над фоном), флюоресценция остальных клеточных линий соответствовала фоновому значению. Накопление siРНК-I в присутствии олигофектамина клетками нейробластомы (SK-N-MC и IMR-32) происходило даже более интенсивно, чем клетками карциномы (KB-3-1). Таким образом, внутриклеточная концентрация siРНК-I была достаточна для эффективной интерференции во всех исследованных клеточных линиях, и причиной разницы в эффективности интерференции в разных клеточных линиях являются другие клеточно-специфичные механизмы, а не процедура трансфекции.

Наши результаты показали, что исследованная siРНК-I, способная эффективно подавлять функцию гена c-myc и ингибировать пролиферацию раковых клеток, может стать основой препарата противораковой терапии.