КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ, УТРАЧИВАЕМЫХ У БОЛЬНЫХ В-КЛЕТОЧНЫМ ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ, С ПОМОЩЬЮ ГЕНОМ-ОРИЕНТИРОВАННОЙ СТРАТЕГИИ ПОИСКА СУПРЕССОРОВ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА
А.В. Баранова
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва
Molecular and Microbiology Department, George Mason University, Fairfax VA, USA
Поиск гена-супрессора опухолевого роста, расположенного на хромосоме 13 и повреждаемого у большинства пациентов с В-клеточным хроническим лимфолейкозом, (В-ХЛЛ) начались в середине 90-х годов, одновременно с появлением первых генетических и физических карт генома человека. В течение 1995-97 гг. в результате работы ряда лабораторий, использовавших методы потери гетерозиготности полиморфных маркеров (LOH), флуоресцентной гибридизации in situ и геномной гибридизации по Саузерну, хромосомный участок, утрачиваемый при ХЛЛ, был сначала минимизирован до 1 млн. н.п., а затем - до 300 т.п.н. Указанный минимальный участок был картирован между STS-маркерами D13S1149 и D13S25 и включал наиболее часто утрачиваемую область, содержащую маркер D13S319. При этом как исследования, проведенные на материале от российских пациентов, так и работы зарубежных авторов указывали на неожиданную гетерогенность хромосомных делеций, в том числе наличие не перекрывающихся делеций не только у разных больных одной и той же формой заболевания больных ХЛЛ, но и зачастую в различных опухолевых клетках одного и того же больного. Это позволило нам высказать гипотезу о низкой стабильности района 13q14.3, выражающейся в высокой склонности этого района к образованию спонтанных делеций, возможно, являющихся не причиной, а последствием опухолевой трансформации В-клетки. Независимым подтверждением нестабильности района 13q14.3 является высокая частота повреждений данного хромосомного участка не только при В-ХЛЛ, но и при многих онкологических заболеваниях, в том числе множественной миеломе, лимфоме мантийной зоны, карциноме простаты и карциномах с локализацией в области головы и шеи.
В начале описываемой работы (1996-1998 гг.) построение полномасштабной траснкрипционной карты исследуемого района представлялось трудоемкой и дорогостоящей задачей. Поэтому с самого начала исследований мы пошли по пути картирования и исследования тех генов, участие которых в процессе развития ХЛЛ являлось наиболее вероятным. Такими генами мы считали транскрибирующиеся участки ДНК, расположенные внутри наиболее часто утрачиваемого хромосомного участка. Мы установили, что район минимальной делеции содержит первые экзоны генов DLEU1 и DLEU2, а также разделяющий их участок, тогда как большая часть первых интронов этих генов и все оставшиеся экзоны находятся за его пределами. Предполагаемым открытым рамкам считывания генов DLEU1 и DLEU2 соответствуют два белка, состоящие из 72 и 84 аминокислотных остатков соответственно, что вызвало у нас большие сомнения в реальном существовании белковых продуктов, кодируемых генами DLEU1 и DLEU2. Интенсивное исследование ДНК больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом методом SSCP также не привело к обнаружению точечных мутаций в указанных генах. Кроме генов DLEU1 и DLEU2 в составе минимального утрачиваемого участка в районе 13q14.3 нами были обнаружены дополнительные экспрессирующиеся участки, обозначенные как DLEU3, DLEUX, DLEU4, DLEU6, DLEU7, DLEU8, DLEU9. Для некоторых из них было показано не только соответствие последовательностям EST из базы данных GenBank, но и наличие соответствующих им изоформ мРНК in vivo с помощью Норзерн-гибридизации. Мы считаем, что к В-ХЛЛ вышеописанные формы отношения не имеют, зато свидетельствуют о высокой транскрипционной активности хромосомного района, наиболее часто утрачиваемого в клетках больных, причем эта активность не является продуктивной с точки зрения синтеза белка. По нашему мнению, указанный феномен может быть связан с феноменом низкой стабильности района 13q14 в клетках больных В-ХЛЛ и иметь общую геномную основу.
Несмотря на изобилие в составе исследуемого района не кодирующих мРНК, в результате экспериментального скрининга кДНК клонотек, приготовленных из В-клеток и сердца, нам удалось клонировать и картировать ген, кодирующий протяженную открытую рамку считывания. Этот ген получил название рабочее название Leu5, впоследствии переименованный в RFP2 (Ret Finger Protein 2). Ген RFP2 расположен несколько в стороне от района минимальной делеции и отделен от нее расстоянием 10 т.п.н. Открытая рамка считывания гена RFP2 состоит из 407 аминокислот и кодирует белок, содержащий цинк-связывающие домены RING и B-box, а также так называемый «спирально скрученный» домен. Такое сочетание доменов называется RFP-подобным трехчастным доменом, по названию белка RFP. Семейство RFP-подобных белков принимает активное участие в процессах, связанных с клеточной дифференцировкой, регуляцией раннего развития эмбриона, иммунного ответа, а также в неопластической трансформации клеток. Многие белки, содержащие цинк-связывающий домен RING типа, являются E2-зависимыми Е3 убиквитин-лигазами, возможно RFP2 также обладает этой ферментативной активностью. В настоящее время мы занимаемся исследованием функции белка RFP2, в том числе поиском его белковых партнеров.
Поскольку результаты экспериментального скрининга генов-кандидатов не принесли ожидаемого результата, и по определению не могли быть исчерпывающими, мы приступили к построению полной карты транскрибирующихся участков, расположенных в составе 13q14.3. В качестве основы для транскрипционной карты была использована физическая карта исследуемого участка хромосомы, созданная в лаборатории анализа генома ИОГен РАН. Эта карта была представлена в виде контигa – наборa непрерывно перекрывающихся фрагментов ДНК. Kосмидные клоны со средним размером 40 т.п.н., а также их отдельные фрагменты были использованы в качестве "масштабной сетки" для определения местоположения генов человека и их отдельных экзонов. Построенный нами космидный контиг перекрыл геномный участок размером 620 т.п.н. и позволил нанести на карту шесть новых экспрессирующихся последовательностей человека, а также три гена, описанных нами ранее.
Одновременно с окончанием работы по построению контиговой карты в базах данных GenBank и Celera появилась информация о полных нуклеотидных последовательностях клонов BAC и PAC, перекрывающих части интересовавшего нас района хромосомы 13, а также об их отдельных участках. Мы тщательно проанализировали доступную информацию об этих последовательностях, и на ее основании смогли смонтировать первую полную физическую карту района 13q14.3, основанную на знании последовательности данного района. Смонтированная нами результирующая нуклеотидная последовательность была использована для BLAST-скрининга базы данных dbEST, что позволило провести исчерпывающее картирование всех экспрессирующихся последовательностей, расположенных внутри интересовавшего нас хромосомного участка.
В ходе этой работы нами был обнаружен и картирован новый ген человека C13ORF1, кодирующий белок размером 196 аминокислот. Белок С13orf1 обладает необычайно высокой степенью консервативности; так, ортологичные последовательности с высокой степенью сходства были обнаружены нами у нематоды C. elegans, насекомого D. melanogaster и рыбы Danio rerio. Степень сходства ортологичных нуклеотидных последовательностей гена C13ORF1 мыши и человека составляет 97%, при среднегеномном сходстве между ортологичными генами порядка 82-85%, что указывает на потенциально высокую значимость продукта этого гена для функционирования клетки. Ген C13ORF1 содержит единственный домен SPRY, функция которого в настоящее время не установлена, хотя показано что в других белках SPRY-домен чаще всего ассоциирован с DEAD-доменом, цинк связывающими доменами BBOX и RING типа, PRY-доменом и BBC-доменом. Эти домены необходимы для осуществления белок–белковых взаимодействий и гомоолигомеризации белков. Тем не менее, мутации гена C13ORF1 у больных ХЛЛ нам обнаружить не удалось.
Кроме того, при детальном экспериментальном анализе кластеров EST, картированных на небольшом расстоянии от гена RFP2, обнаружилась неожиданная сложность этого экспрессирующегося хромосомного участка. Оказалось, что тот же самый хромосомный локус кодирует антисмысловой транскрипт, имеющий длину 1768 нуклеотидов, состоящий из пяти экзонов и частично перекрывающий 5’-концевую не транслируемую область гена RFP2. Этот транскрипт был зарегистрирован нами в базе данных GenBank под названием RFP2OS (RFP2 Opposite Strand). Наличие транскрипта RFP2OS в клеточных линиях К562 и Lim1215 было подтверждено экспериментально с использованием ОТ-ПЦР, при отсутствии транскрипта в линиях T47D, SKOV-3 и SAOS-2. Поскольку траснкрипт RFP2OS является эндогенным антисмысловым траснкриптом для гена RFP2, можно предположить, что изоформа РНК гена RFP2OS принимает участие в регуляции экспрессии и, как следствие, трансляции гена RFP2.
Кроме того, на расстоянии менее 1 т.п.н. от последнего 3’-концевого нуклеотида гена RFP2 нами был картирован ген KCNRG (K+ Channel Regulating Gene), не описанный ранее. В настоящее время вопрос о том, является ли данный ген самостоятельной транскрибирующейся единицей, или же синтез мРНК гена KCNRG затравляется с промотора RFP2 остается открытым – мы работаем над решением данной задачи. Белковый продукт гена KCNRG содержит единственный домен Т1, являющийся N-концевым цитоплазматический доменом, ответственным за тетрамеризацию ?-субъединиц калиевых каналов, открывающихся в зависимости от разности потенциалов на мембране клетки. Этот домен имеет также отдаленную гомологию с BTB/POZ доменом, который участвует в белок-белковых взаимодействиях и присутствует во многих транскрипционных факторах. Большинство исследованных белков, содержащих Т1-домен, являются потенциал-зависимыми калиевыми каналами, которые лучше всего изучены в электрочувствительных клетках мозга, скелетных и сердечных мышцах.
Несмотря на содержание хорошо выраженного домена T1, белок KCNRG не содержит трансмембранных доменов и является растворимым, что позволило нам выдвинуть гипотезу о том, что белковый продукт гена KCNRG регулирует активность потенциал-зависимых калиевых каналов, подавляя процесс их сборки в октамеры. Для проверки этой гипотезы мы создали KCNRG-содержащие конструкции на базе вектора pEGFP-N1, кодирующего зеленый флюоресцентный белок. Данные конструкции были переданы нашим французским коллегам из лаборатории нейрофизиологии (University of Bordeaux II, France), которым удалось показать, что сверхэкспрессиия белка KCNRG в клетках карциномы простаты LNCaP в действительности приводит к снижению тока калия. Этот результат свидетельствует о возможном участии белкового продукта гена KCNRG в регуляции калиевых каналов, по крайней мере, в клеточной линии LNCaP.
Ранее другими исследователями было показано, что активность калиевых каналов является одним из ключевых факторов, определяющих переход клеток из фазы G1 клеточного цикла к митозу, причем усиление экспрессии генов калиевых каналов или активности их белковых продуктов ускоряется делением. В частности, активность потенциал-зависимых калиевых каналов усиливает пролиферацию лимфоцитов. Поскольку KCNRG способен подавлять активность калиевых каналов, это может приводить к ослаблению митотической активности; утрата гена KCNRG, происходящая при делециях исследуемого нами участка хромосомы 13, может способствовать выживанию опухолевых клеток у больных В-ХЛЛ.
Стоит отметить, что поиск гена-супрессора, расположенного в области q14.3 хромосомы 13, ведется десятками лабораторий в разных странах. В результате этой работы выделены девять генов и генных фрагментов, рассматривавшихся в качестве кандидатных. Однако, несмотря на интенсивный мутационный скрининг, проведенный на десятках образцов опухолевой ДНК пациентов с В-ХЛЛ, мутации в описанных генах обнаружены не были.
В литературе описан такой феномен как гапло-недостаточность (haploinsufficiency), когда одной копии гена недостаточно для нормальной функции, а инактивация даже одного из двух аллелей может вызвать болезнь. Такие предположения были выдвинуты, например, для синдрома Di George, болезни Гиршпрунга, синдрома Bloom, карциномах с локализацией в области головы и шеи. Предполагают, что гаплонедостаточность по гену Flap Endonuclease (Fen1) приводит к быстрой прогрессии опухолей.
Можно предположить, что и в нашем случае, гаплонедостаточность одного или нескольких генов в критической области (13q14.3) является причиной развития В-ХЛЛ и других онкологических заболеваний, характеризующихся потерей генетического материала в этом районе. Несмотря на большую проделанную работу, исследования по определению гена, нарушение которого приводит к развитию указанных онкологических заболеваний, остается насущной и продолжается.
Список литературы:
1. Kapanadze B, Kashuba V, Baranova A. et al.// FEBS Lett. 1998 v.17,n.426, p.266-70.
2. Tiazhelova TV, Ivanov DV, Makeeva NV et al.// Genetika. 2001 v.37, p.1530-7.
3. Kapanadze B, Makeeva N, Corcoran M, et al// Genomics. 2000 Dec 15;70(3):327-34
4. Kapanadze B, Kashuba V, Baranova A. et al.// FEBS Lett. 1998 Apr 17;426(2):266-70
5. Kapanadze BI, Brodianskii VM, Semov AB. Et al// Mol Biol (Mosk). 1997 May-Jun;31(3):515-9
6. Ivanov DV, Tyazhelova TV, Lemonnier L et al.// FEBS Lett. - 2003 v 27;n.539, p. 156-60.
7. van Everdink WJ, Baranova A., Lummen C. et al // Cancer genetics and Cytogenetics 2003 v.145, p 1-10.
