Материалы конгрессов и конференций

VII РОССИЙСКАЯ ОНКОЛОГИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

МУТАЦИИ В ПРТООНКОГЕНЕ RET: РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ МЕДУЛЛЯРНОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ВОЗМОЖНОСТИ ДОКЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Ф.А. Амосенко1, В.Ж. Бржезовский2, Л.Н. Любченко2, М.А. Шабанов2, В.М. Козлова2, Е.И. Трофимов3, Э.В. Ванушко4, В.Н. Калинин1, 5, Р.Ф. Гарькавцева2

1МГНЦ РАМН, Москва,
2ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва,
3МНИОИ им. П.А. Герцена, Москва
4ЭНЦ РАМН, Москва
5Хирургическая клиника Гамбургского университета, отдел общей хирургии, Гамбург

I. Медуллярный рак щитовидной железы

Медуллярный рак щитовидной железы (МТС - Medullar Thyroid Carcinoma)-нейроэндокринная опухоль, образующаяся из парафолликулярных клеток или С-клеток щитовидной железы, являющихся производными неврального гребня и ответственных за синтез кальцитонина. Это довольно редкое заболевание составляет 5-10% от всех карцином щитовидной железы. МТС может возникать спорадически (примерно в 70-80% случаев) или является главной составной частью наследственного синдрома множественной эндокринной неоплазии типа 2 (MEN2 - Multiple Endocrine Neoplasia type 2).

Особенностью клинического проявления этого ракового синдрома с доминантным типом наследования является фенотипический полиморфизм, с учетом которого различают три хорошо охарактеризованных подтипа: MEN2A, MEN2B и семейный медуллярный рак щитовидной железы (FMTC - Familial MTC). Наследственный МТС присутствует в 95-100% случаев всех MEN2 подтипов. Для MEN2A (80-90% среди MEN2 синдромов) характерно также наличие феохромоцитомы (около 50%) и гиперпаратиреоза (20-30%). Феохромоцитома присутствует примерно у 50% больных с подтипом MEN2B, однако, гиперпаратиреоз в этих случаях встречается редко. Для третьего подтипа MEN2 синдрома-FMTC характерен только наследственный МТС.

Варьирующая экспрессивность и неполная пенетрантность, характерные для MEN2 синдромов, являются причиной значительной межиндивидуальной изменчивости (даже в пределах одного подтипа) как по возрасту начала заболевания, так и по тяжести его проявления, что в настоящее время создает определенные трудности при клинической диагностике С-клеточной гиперплазии и МТС на ранней стадии развития.

II. Протоонкоген RET

Этиологическим фактором заболеваний с наследственными формами МТС, т.е. с синдромами MEN2, практически во всех изученных случаях являются герминальные миссенс-мутации в протоонкогене RET. Ген RET (REarranged during Transfection) кодирует тирозинкиназу рецепторного типа. Он локализован на длинном плече хромосомы 10 (10q11.2) и охватывает около 60 kb геномной ДНК, включает 21 экзон. Известны три изоформы RET белка, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга 3`-конца транскрипта: RET9, RET43 и RET51. Подобно другим рецепторным тирозинкиназам молекула RET белка включает большой внеклеточный домен, участвующий в узнавании и связывании его лигандов и корецепторов, трансмембранный домен и внутриклеточный тирозинкиназный домен, участвующий в фосфорилировании активированной тирозинкиназы RET, в стимулировании ее сигнальных путей.

Лигандами для рецептора RET являются 4 близко родственных нейротрофных фактора, относящихся к суперсемейству трансформирующего фактора роста ? (TGF?-Transforming Growth Factor ?). Это нейротрофный фактор глиальных клеток (GDNF - Glial cell line Derived Neurotrophic Factor), ньюртурин, персефин и артемин. GDNF лиганды (GFL) связываются с трансмембранным рецептором RET через их высоко аффинные корецепторы семейства GFR?: GFR?-1-4. Установлено, что GFR?-1 связывается с высоким сродством с GDNF, GFR?-2 - с ньюртурином, GFR?-3 – с артемином, а GFR?-4 – c персифином. В норме все эти комплексы GFL-GFR? приобретают способность взаимодействовать с общим сигнальным рецептором RET, запуская его димеризацию на клеточной поверхности и автофосфорилирование во внутриклеточном домене. Для каждого из членов семейств GDNF и GFR? характерны различные, частично перекрывающиеся паттерны экспрессии, а также разные роли в процессах пролиферации клеток. Это предполагает, что активация тирозинкиназы RET различными комплексами GFL-GFR? является строго регулируемым процессом, а также может быть одним из объяснений большого количества фенотипов, ассоциированных с активацией протеинкиназы RET.

III. Мутации в протоонкогене RET

В отличие от других заболеваний, ассоциированных с RET, наследственный МТС является результатом активации этого гена с помощью миссенс-мутаций. При MEN2A герминальные мутации в гетерозиготном состоянии обнаружены во внеклеточном домене Ret. Они затрагивают 1 из 5 цистеиновых кодонов или участки, окружающие эти кодоны, в богатом цистеином домене RET белка: мутации в кодонах 609, 611, 618, 620 (экзон 10) и 634 (экзон 11) обнаружены более чем у 98% больных. При этом около 87% MEN2A мутаций присутствуют в кодоне 634. Наиболее частая аномалия в этом кодоне (около 50% всех MEN2A мутаций) приводит к замене цистеина на аргинин. В результате каждой из перечисленных выше мутаций цистеиновые остатки, в норме участвующие в образовании внутримолекулярных дисульфидных связей, определяющих четвертичную структуру белка, образуют межмолекулярные связи с другими мутантными молекулами RET, индуцируя тем самым лиганд-независимую гомодимеризацию белка, что, в свою очередь, приводит к перманентной, нерегулируемой активации протеинкиназы RET.

Большую часть MEN2A мутаций обнаруживают также у больных с FMTC: однонуклеотидные замены в 1 из 5 цистеиновых кодонов (609, 611, 618, 620 или 634) в гетерозиготном состоянии присутствуют более чем в 80% семей. Однако, в отличие от MEN2A, герминальные миссенс-мутации при FMTC, во-первых, относительно равномерно распределены среди этих кодонов, а во-вторых, с гораздо меньшей частотой они встречаются в кодонах 609, 611 и 634. В единичных случаях при FMTC обнаружены миссенс-мутации во внутриклеточном тирозинкиназном домене RET в нецистеиновых кодонах: 768 (экзон 13), 804 (экзон 14) и 883 (экзон15). Мутации в тирозинкиназном домене также способны активировать RET независимо от лиганда. Полагают, что они могут изменять субстратную специфичность протеинкиназы RET, или увеличивать способность ее рецептора связывать АТР, что, по-видимому, стимулирует активацию сигнальных путей, приводящих к бесконтрольной пролиферации клеток.

При MEN2B более чем у 95% больных обнаруживают одну и ту же миссенс-мутацию в кодоне 918 (экзон 16), вызывающую замену метионина на треонин, а у 3% - замену А883F (экзон 15). Эти мутации находятся внутри каталитического ядра протеинкиназы RET. Показано, что эти мутации приводят к лиганд-независимой конститутивной активации тирозинкиназы RET, но без димеризации последней. Однако при MEN2B интенсивность сигнала от мутантного рецептора может быть увеличена связыванием лиганда. Мутация М918Т изменяет также субстратную специфичность протеинкиназы RET, что приводит к автофосфорилированию остатков тирозина по новым сайтам, а также к преимущественному фосфорилированию новых белков - цитоплазматических тирозинкиназ c-src и c-abl - отсутствующему в норме. Таким образом, мутации протоонкогена RET, приводящие к перманентной стимуляции его тирозинкиназной активности, являются онкогенными. Они способны вызывать морфологическую трансформацию клеток, культивируемых in vitro, и ответственны за развитие наследственных раковых синдромов MEN2. Кроме того, на животных моделях было показано, что экспрессия трансгена RET MEN2A приводит к развитию у мышей опухолей щитовидной железы, морфологически сходных с МТС человека, а в случае с трансгеном RET MEN2B - к развитию нейроглиальных опухолей мышей, гистологически идентичных ганглионейромам человека.

IV. Корреляция между генотипом и фенотипом

Из изложенного выше прослеживается взаимосвязь специфических RET мутаций с каждым подтипом MEN2; в то же время очевидно частичное перекрывание этих мутаций, особенно для MEN2A и FMTC. Ассоциация между положением и типом мутаций в протоонкогене RET с фенотипом заболевания становится четче при обращении к типам опухолей MEN 2 синдромов. На основании анализа большого количества независимых MEN2 семей были сделаны следующие выводы:

    1) существует ассоциация между герминальными мутациями в кодоне 634 и присутствием в семьях с MEN2A феохромоцитомы и гиперпаратиреоза;

    2) мутация C634R до сих пор не была обнаружена ни в одной из семей с FMTC, что позволяет рассматривать ее в качестве строгого маркера при прогнозировании риска развития феохромоцитомы и гиперпаратиреоза у бессимптомных носителей этой мутации;

    3) и, наоборот, герминальные мутации в кодонах 768, 804 и 891 до сих пор были обнаружены исключительно у больных с FMTC, поэтому их можно рассматривать как маркеры низкого риска развития феохромоцитомы и гиперпаратиреоза;

    4) герминальные мутации в кодонах 918 и 883 характерны исключительно для MEN2B.

Таким образом, эти высокоспецифические аномалии протоонкогена RET можно использовать при уточнении диагноза, при скрининге, прогнозировании, контроле и профилактике MEN2. Объяснение этой корреляции в настоящее время отсутствует. Существуют лишь предположения, что она может быть связана с различными уровнями активации тирозинкиназы RET, индуцируемой разными герминальными мутациями, а также с различной чувствительностью разных тканей к активированному RET с максимальной чувствительностью С-клеток щитовидной железы и с наименьшей чувствительностью околощитовидных желез.

V. RET мутации при спорадических формах МТС и феохромоцитомах

В зависимости от выборок больных, а также от методов молекулярного исследования у 23-70% больных со спорадическим МТС обнаружены соматические мутации в одном из аллелей протоонкогена RET. Как правило, эти аномалии часто возникают в кодирующей области гена RET в дополнение к уже сообщенным мутациям в «горячих» точках. Наиболее распространенной в этой группе больных является замена метионина на треонин в кодоне 918, ассоциированная с MEN2B фенотипом. С гораздо меньшей частотой встречаются мутации в цистеин-богатом домене, а также в экзонах 13-15. Следует отметить, что около 6% форм со спорадическим МТС оказываются случаями de novo MEN2A и FMTC, и около 50% - de novo MEN2B. Существуют данные, свидетельствующие о том, что, в отличие от герминальных, соматические мутации в протоонкогене RET не являются инициирующими, они нужны для прогрессии опухолей. Эти данные, а также обнаружение мутации в кодоне 918 только у небольшой части больных со спорадическим МТС предполагают, что к этому заболеванию могут быть причастны еще неизвестные факторы.

Гораздо реже соматические мутации в протоонкогене RET встречаются у больных со спорадической феохромоцитомой (10-15% случаев), что может быть следствием более низкой чувствительности клеток надпочечников к активации RET. Наиболее распространенной аномалией и в этом случае является мутация в кодоне M918T. Она обнаружена примерно у 50% больных. Есть сообщения и о других соматических миссенс-мутациях в экзонах 10 и 11, а также о делециях в цистеин-богатой области RET, присутствующих в небольших (единичных) количествах феохромоцитом.

VI. Сигнальные пути RET

Активация трансмембранного рецептора RET в норме при связывании с комплексом лиганд-корецептор или вследствие мутаций при наследственном МТС приводит к автофосфорилированию, которое в свою очередь активирует различные сигнальные пути RET, стимулирующие рост, дифференцировку или выживание клеток в зависимости от типа клеток или стадии их развития, на которой произошла индукция RET. Фосфорилированию могут подвергаться 9 из 18 внутриклеточных остатков тирозина, что делает их местами для посадки сигнальных молекул и предполагает множество всевозможных каскадных взаимодействий. Активированная тирозинкиназа RET связывается с SH2 доменами таких белков, как фосфолипаза С/? (PLC?) (Y1015), Shc (Y1062), src, Crk и Nck. Кроме того, Grb2 взаимодействует с Y1096, характерным только для длинной изоформы RET51. RET также взаимодействует с Grb7 и 10 (Y905). Механизмы активации RET посредством MEN2A и MEN2B мутаций разные, поэтому неудивительно, что для трансформации in vitro в этих подтипах нужны различные остатки тирозина. Так, фосфорилирование Y864 и Y952 является критическим при трансформации, опосредуемой MEN2B мутацией M918T, а фосфорилирование Y905 существенно для трансформации, стимулируемой мутациями MEN2A. Y1015, Y1062 и Y1096 являются универсальными: они необходимы для трансформирующего действия in vitro всех мутаций. Отметим различную способность адапторных белков связываться с Y1062 в составе трех изоформ RET, что объясняется различием их С-концевых участков. В соответствии с этими отличиями RET изоформы обладают различными способностями при индукции трансформации или дифференцировки in vitro, а также отличающейся экспрессией in vivo.

При участии по-разному ассоциированных адапторных белков RET активирует несколько сигнальных путей, среди которых особого внимания заслуживают два, включающие активируемые митогенами протеинкиназы (МАРК) и фосфатидил-инозитол-3-киназу (PI3K). Индуцируемый непосредственно Grb2 (Y1096) или сигнальными адапторами Shc и Grb2 (Y1062) переход белков Ras в активированное состояние приводит к стимулированию MAP-киназных каскадов, которые необходимы для выживания и дифференцировки нейронов. Адапторные белки Grb7 или 10 также причастны к активации Ras-MAPK каскадов. RET активация PI3-киназы, по-видимому, происходит при взаимодействии с Shc, Grb2 и Gab1 (Y1062), которые могут рекрутировать p85, регуляторную субъединицу PI3K. Активированная PI3-киназа влияет на клеточную подвижность, что приводит к образованию ламеллоподий или раффлинг мембран (признаки трансформированного фенотипа), а также к фосфорилированию белков, причастных к образованию фокальных адгезий, включая паксиллин, киназу FAK и Crk-ассоциированный субстрат p130 cas. Кроме того, RET через PI3-киназу стимулирует серин-треониновую протеинкиназу B/АКТ (PKB/AKT), активация которой очень важна для выживания и пролиферации клеток. С другой стороны, показано, что активированная киназа B/AKT предотвращает вступление клеток в апоптоз, и причастна к онкогенному действию RET. Действие MEN2A и MEN2B мутаций приводит к перманентной активации PI3-киназы и адапторных белков ее сигнального пути. Не исключено, что именно опосредованная каскадом PI3K-PKB/AKT защита клеток от апоптоза и их митогенное действие необходимы для проявления онкогенной активности RET при MEN 2 синдромах. Установлено также, что RET активирует сигнальный путь киназы JNK через cdc42/RAC1 малой GTPазы, которая способствует образованию неопластического фенотипа. Еще один сигнальный каскад RET, включающий PLC?, взаимодействующую с Y1015, также необходим для полного проявления онкогенного действия RET.

VI. Диагностика МТС

В настоящее время ранний генетический скрининг герминальных RET мутаций позволяет выявить индивидов из группы риска до появления у них клинических или биохимических симптомов. Прогностическое и диагностическое тестирование облегчается большим количеством случаев обнаружения герминальных RET мутаций (>95%) и наличием «горячих» кодонов. Индивиды из MEN2 семей с идентифицированной мутацией, не являющиеся носителями таковой, не входят в группу риска. Бессимптомным носителям мутаций из таких семей рекомендуют профилактическую тиреоидэктомию в раннем возрасте.

При молекулярной диагностике МТС применяют методы ПЦР, SSCP-анализа, гетеродуплексного анализа, рестрикционного анализа, секвенирование и др.

Используя эти методы, мы исследовали спектр RET мутаций у 19 больных со спорадическим МТС и у 15 больных с наследственными формами МТС. Молекулярная патология, выявленная нами у больных, представлена в таблице 1. В группе больных со спорадической формой МТС при исследовании 5 экзонов (10, 11, 13, 15 и 16) мутации были выявлены и идентифицированы в опухолях 9 больных (47,4%). При этом выявлено 6 типов соматических мутаций, 3 из них - новые. Все они являются миссенс-мутациями и присутствуют в гетерозиготном состоянии, т.е. только в одной из копий гена RET. Наиболее частой мутацией оказалась замена ATG (Мet)>ACG (Thr) в кодоне 918. Она позволила нам идентифицировать 31,6% МТС аллелей. Две новые соматические мутации в кодонах 639 GCA (Ala)>GGA (Gly) и 641 GCT (Ala)>CGT (Arg) обнаружены у одного больного. С помощью аллель-специфической ПЦР и автоматического секвенирования мы показали, что эти мутации находятся на одном аллеле. При скрининге новой мутации в кодоне 922 TCC (Ser)>TTC (Phe) в группе здоровых доноров (обследованы 50 человек) и в группе больных со спорадическим МТС эта мутация не обнаружена. Клиническое значение этих мутаций в настоящее время не известно. У 3 больных мы выявили мутацию de novo MEN2B: замену метионина на треонин в кодоне 918.

В группе индивидов с наследственным МТС (исследовали экзоны 10, 11 и 16) выявлено 4 типа известных миссенс-мутаций: три в кодоне 634 и одна в кодоне 918 (табл. 1). Мутации обнаружены у всех обследованных. На основании этих данных четырем бессимптомным носителям RET мутаций из трех семей с MEN2A (№23, 25, 26 и 27 в таблице) в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России была проведена тиреоидэктомия.

В результате нашего исследования с целью ранней диагностики и профилактики наследственного МТС в семьях, отягощенных MEN2 синдромами, был разработан подход, который предполагает три этапа мероприятий:

    1) генетический скрининг на выявление и регистрацию российских MEN2 семей;

    2) ДНК-диагностику бессимптомных членов семей с наследственным МТС (группа риска), дающую индивидуальный прогноз, предусматривающий в зависимости от типа RET мутаций профилактическое удаление щитовидной железы;

    3) клинический мониторинг индивидов из группы риска. Все эти действия позволят снизить риск онкологического заболевания. Кроме того, пациентов со спорадическим МТС необходимо проверять на наличие герминальных мутаций в протоонкогене RET, поскольку из данных литературы, а также из наших собственных результатов известно, что примерно для 15% индивидов из этой группы характерно наличие таких миссенс-мутаций.

Таблица 1.
Молекулярная патология пациентов с МТС

Пациент Источник ДНК Экзон Кодон Замена Сайт рестрик-
ции для эндо-
нуклеазы
нуклеотида амино-кислоты
Спорадические варианты
1 опухоль 16 918 ATG→ACG Met→Thr Fok I
3* опухоль 16 922 TCC→TTC Ser→Phe EcoR I
3 норм. ткань 16 922 - - EcoR I
6 опухоль 11 634 TGC→CGC Cys→Arg Hha I
6 опухоль 16 918 ATG→ACG Met→Thr Fok I
7 опухоль 11 634 TGC→TAC Cys→Tyr **
7 норм.ткань 11 634 TGC→TAC Cys→Tyr **
8 опухоль 16 918 ATG→ACG Met→Thr Fok I
11 опухоль 16 918 ATG→ACG Met→Thr Fok I
12* опухоль 11 639 GCA→GGA Ala→Gly **
12 норм. ткань 11 639 - - **
12* опухоль 11 641 GCT→CGT Ala→Arg **
12 норм. ткань 11 641 - - **
13 опухоль 16 918 ATG→ACG Met→Thr Fok I
13 норм. ткань 16 918 - - Fok I
16 опухоль 16 918 ATG→ACG Met→Thr Fok I
16 норм. ткань 16 918 ATG→ACG Met→Thr Fok I
Наследственный МТС
20 кровь 16 918 ATG→ACG Met→Thr Fok I
21 кровь 16 918 ATG→ACG Met→Thr Fok I
22 кровь 11 634 TGC→CGC Cys→Arg Hha I
23 кровь 11 634 TGC→CGC Cys→Arg Hha I
24 кровь 11 634 TGC→CGC Cys→Arg Hha I
25 кровь 11 634 TGC→CGC Cys→Arg Hha I
26 кровь 11 634 TGC→CGC Cys→Arg HhaI
27 кровь 11 634 TGC→GGC Cys→Gly **
28 кровь 11 634 TGC→GGC Cys→Gly **
29 кровь 11 634 TGC→TTC Cys→Phe **
30 кровь 11 634 TGC→TTC Cys→Phe **
31 кровь 11 634 TGC→CGC Cys→Arg Hha I
32 кровь 16 918 ATG→ACG Met→Thr Fok I
33 кровь 16 918 ATG→ACG Met→Thr Fok I
34 кровь 16 918 ATG→ACG Met→Thr Fok I

* - новые мутации
** - SSCP-анализ +сиквенс