Материалы конгрессов и конференций

IV РОССИЙСКАЯ ОНКОЛОГИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

ВОЗДЕЙСТВИЕ НОВЫХ АКТИВНОСТЕЙ МУТАНТНЫХ р53 НА КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ЦИТОСТАТИКАМ

Копнин Б.П. 1, С.А. Сергеев 1, Г.В. Ильинская 1, О.Ю. Семеняк 1, Е.Н. Пугачева 2, П.М. Чумаков 2

1 ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;
2 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Москва

Опухолевый супрессор р53 является центральным компонентом внутриклеточной охранной системы, предотвращающей размножение и накопление в организме аномальных клеток. К р53 ведут многочисленные сигнальные пути, распознающие различные внутриклеточные изменения, такие как повреждения ДНК, недостаток пула нуклеотидов, гипоксия, тепловой и холодовой шок, вирусная инфекция, экспрессия активированных онкогенов, разрушения цитоскелета и т.д. Действие этих факторов приводит к стабилизации р53, изменению его конформации и переходу в функционально активное состояние. Являясь транскрипционным фактором, активированный р53 изменяет экспрессию ряда генов-мишеней, продукты которых регулируют продвижение по клеточному циклу (p21 WAF1, Gadd45, 14-3-3s, jqклин В и др.) и апоптоз (Bax, Bcl2, PIG3, Fas, Killer/DR5 и др.). В результате активация р53, вызываемая различными внутриклеточными изменениями, приводит либо к остановке клеточного цикла в G1 и G2 фазах, либо к гибели клетки. Таким образом, р53 выполняет важнейшую охранную функцию, осуществляя выбраковку аномальных и потенциально опасных клеток. Нарушения функции р53 резко увеличивают вероятность развития новообразований. Так, врожденные мутации р53 вызывают синдром Ли-Фраумени, характеризующийся развитием в молодом возрасте множественных первичных опухолей.

Нарушения функции р53 являются наиболее универсальным молекулярным изменением в различных новообразованиях человека. Они могут возникать либо еще в нормальной клетке и увеличивать таким образом вероятность образования из нее неопластического клона, либо происходить уже в опухолевых клетках и детерминировать дальнейшую прогрессию новообразования. Следует подчеркнуть, что, изменяя регуляцию чекпойнтов клеточного цикла и апоптоза, нарушения функции р53 модифицируют чувствительность клеток к противоопухолевым препаратам.

Как правило, в опухолях выявляются миссенс-мутации р53, приводящие к замене одной из аминокислот на другую, причем с наибольшей частотой мутации встречаются в трех "горячих точках": кодонах 175, 248 и 273. Вероятно, экспрессия мутантного р53 придает клетке дополнительные селективные преимущества по сравнению с клетками, в которых изменения в гене р53 приводят просто к потере экспрессии поврежденного аллеля. Этот факт может объясняться, по крайней мере, двумя причинами. Во-первых, мутантный белок обладает доминантно-негативным эффектом в отношении белка дикого типа, то есть точечная мутация даже в одном из двух аллелей способна полностью подавить охранную функцию р53. Во-вторых, в последнее время появляются данные, указывающие на существование у мутантных форм р53 вновь приобретенных активностей ("gain-of-function"). Известно, например, что за счет таких активностей мутантный р53 может специфически и с высокой аффинностью связываться с МАR/SАR ДНК-элементами, вызывая ремоделирование хроматина, транс-активировать промоторы ряда генов (онкогена myс, рецептора эпидермального фактора роста и др.), а также увеличивать метастатический потенциал опухолевых клеток. Однако молекулярные основы вновь приобретенных активностей и их роль в процессах канцерогенеза пока практически не изучены.

Мы предприняли попытку исследовать влияние вновь приобретенных активностей мутантного р53 на регуляцию клеточного цикла, апоптоза и чувствительности к цитостатикам. Для этого были изучены эффекты мутантных р53 с аминокислотными заменами в кодонах 175, 248 или 273, являющихся "горячими точками" мутаций в различных опухолях человека. Новые активности мутантных р53 выявляли путем их трансдукции в культивируемые in vitro клетки, не продуцирующие эндогенный р53. Использование клеток, в которых отсутствует экспрессия эндогенного р53, позволяло исключить проявления доминантно-негативного эффекта и исследовать действие только вновь приобретенных активностей трансдуцированного мутантного р53.

Нами были получены и проанализированы производные клеток мыши и человека с конститутивной или тетрациклин-репрессируемой экспрессией экзогенного р53. В последнем случае экспрессия мутантного р53 подавлялась добавлением в культуральную среду тетрациклина (1 мкг/мл). Через 24-48 ч после перевода полученных нами сублиний клеток в среду без тетрациклина наблюдается индукция экспрессии экзогенного мутантного р53, не сопровождающаяся повышением экспрессии генов-мишеней р53 дикого типа (p21 WAF1 и др.).

Воздействие новых активностей мутантных р53 на клеточный цикл и скорость пролиферации клеток

Вновь приобретенные активности мутантного р53 вызывают существенное увеличение скорости пролиферации клеток. Так, введение вектора, конститутивно экспрессирующего мутантный р53-His175, повышает скорость размножения р53-негативных мышиных фибробластов линии 10 (3) примерно в 1,5 раза: в логарифмической фазе роста время удвоения клеточной популяции уменьшалось с 23,5 ч до 16 ч. Сходная картина наблюдалась и в случае тетрациклин-регулируемой экспрессии р53-His175 в клетках человеческой карциномы легкого линии Н1299 или мышиных фибробластах линии 10 (1), что подтверждало связь выявленных различий в скорости пролиферации именно с экспрессией мутантного р53, а не с какими-то вторичными изменениями, возникающими в результате длительной селекции клеток с экзогенным мутантным р53. Следует подчеркнуть, что индукция экспрессии р53 дикого типа в этих клеточных контекстах приводила не к уменьшению, а к увеличению времени удвоения клеточной популяции или к апоптозу.

Ускорение размножения клеток под влиянием вновь приобретенных активностей мутантного р53 обусловлено, по-видимому, их воздействием на регуляцию клеточного цикла. Анализируя кинетику появления меченых митозов после добавления 5-бромдезоксиуридина на 20 мин., мы определяли продолжительность отдельных фаз клеточного цикла в логарифмической фазе роста. Оказалось что, включение экспрессии мутантного р53 значительно уменьшает время прохождения клеточного цикла за счет существенного укорочения продолжительности S-фазы. При этом мутантный р53 не оказывал существенного влияния на продолжительность других фаз клеточного цикла.

Вновь приобретенные активности мутантного р53, помимо изменений регуляции клеточного цикла при нормальных физиологических условиях, могут модифицировать функцию G 1-чекпойнта, активируемого повреждающими воздействиями. Мы обнаружили, что индукция экспрессии мутантного р53-His175 в клетках 10 (1) и Н1299 приводит к тому, что в S-фазу входит в 1,5-2 раза больше клеток с повреждениями ДНК, индуцированными алкилирующим соединением этилметансульфонатом (ЭМС), тогда как экспрессия р53 дикого типа, наоборот, уменьшает долю поврежденных клеток, входящих в S-фазу. В то же время р53-His175 практически не влияет на активность чекпойнта, оперирующего в G2.

Механизмы выявленных нами эффектов вновь приобретенных активностей мутантного р53 в отношении регуляции клеточного цикла пока неясны. Наиболее вероятным является предположение о том, что эти изменения связаны со способностью р53-His175 увеличивать экспрессию гена myc. Его продукт, как было показано ранее, может, с одной стороны, транс-активировать ген орнитин-декарбоксилазы и вызывать, таким образом, укорочение S-фазы, а с другой стороны активировать комплексы циклин E/Cdk2 и отменять остановку поврежденных клеток при переходе из G1 в S.

Воздействие новых активностей мутантных р53 на индукцию апоптоза

Мутантные р53 могут модифицировать действие цитостатиков, изменяя не только регуляцию G1-чекпойнта, но и ослабляя индукцию апоптоза. При этом, новые активности мутантного р53 воздействуют как на апоптоз, вызываемый повреждениями ДНК, так и на апоптоз, индуцируемый "доменами смерти" ("death receptors") после добавления в культуральную среду TNF-a или антител к Fas. Следует подчеркнуть, что такие эффекты мутантных р53 в значительной степени зависят от конкретной аминокислотной замены, типа апоптоза и, возможно, клеточного контекста. Так, p53-His175, значительно сильнее, чем p53-Trp248 или p53-His273, подавляет апоптоз, вызываемый ДНК-повреждающими воздействиями (ЭМС, этопозид). В то же время p53-His273 сильнее, чем p53-His175, подавляет Fas-индуцируемый апоптоз в человеческих клетках рака простаты линии PС-3. Кроме того, различные мутантные р53 дифференциально воздействуют на апоптоз, индуцируемый Fas и TNF-a.

Механизмы действия вновь приобретенных активностей мутантных р53 на регуляцию апоптоза исследованы пока довольно плохо. Недавно обнаружено, что одним из путей такой регуляции может являться транс-активация гена BAG1, кодирующего антиапоптотический белок семейства Bcl2.

Воздействие новых активностей мутантных р53 на чувствительность к химиопрепаратам

Помимо неспецифического воздействия на чувствительность к цитостатикам посредством изменения регуляции клеточного цикла и апоптоза, новые активности мутантных р53 могут оказывать и более специфическое действие на чувствительность к определенным лекарственным средствам путем изменения регуляции мишеней химиопрепарата. Используя метод субтрактивной гибридизации мы идентифицировали неизвестные ранее мишени трансактивационного действия мутантных р53 и обнаружили, что в группу генов, специфически активируемых мутантными р53, входит ген, кодирующий дезокси-УТФ-азу. Функция дУТФазы заключается в гидролизе дУТФ до дУМФ и пирофосфата. В свою очередь, дУМФ служит субстратом для образования дТТФ de novo. Предполагается, что повышение уровня дУТФазы может вызывать устойчивость к 5-фторурацилу, широко применяемому химиопрепарату, механизм действия которого связан с ингибированием синтеза дТТФ путем подавления активности тимидилатсинтетазы. Мы обнаружили, что индукция экспрессии р53-His175 или p53-His248, также как и введение конструкта, экспрессирующего УТФ-азу, во всех исследованных нами культурах (карцинома легкого H1299, рак яичника SKOV-3, фибробласты 10 (1) в 1,5-2 раза увеличивала число клеток, способных образовывать колонии после воздействия 5-фторурацила. При этом устойчивость к двум другим препаратам - метотрексату и адриамицину - не увеличивалась. В то же время р53-His273, не обладающий способностью транс-активировать ген УТФ-азы, не увеличивал устойчивость данных клеточных культур к 5-фторурацилу.

Очевидно, существуют и другие пути, посредством которых вновь приобретенные активности мутантных р53 оказывают влияние на чувствительность клеток к тем или иным цитостатикам. Так, мы обнаружили, что в лейкозных клетках линии К562, в отличие от клеток 10 (1) и др., экспрессия p53-His175 вызывает существенное уменьшение чувствительности к метотрексату. Экспрессия этого мутанта несколько увеличивала также устойчивость лейкозных клеток к действию винбластина, но практически не меняла чувствительности к этопозиду. В то же время, экспрессия p53-His273 не понижала, а, наоборот, несколько повышала чувствительность клеток К562 к метотрексату и винбластину. Механизмы этих эффектов остаются неясными.

Таким образом, мы обнаружили, что вновь приобретенные активности мутантных р53 с аминокислотными заменами в разных положениях различным образом влияют на чувствительность к разным химиопрепаратам. При этом могут отличаться не только эффекты разных мутантных р53 в одном и том же типе клеток, но и действие одного и того же мутанта в клетках разного происхождения. Все это необходимо учитывать при предпринимающихся в настоящее время попытках использовать мутации р53 для предсказания результатов противоопухолевой химиотерапии.